在过去的15年内，重组DNA技术的发展使得人们能在分子水平上对特殊的基因作详细地研究。生物科学的许多领域如遗传学、分子生物学、细胞生物学和发育生物学所获得的成果都是巨大的，这些进展的取得是对一定量的物种主要是人、鼠、果蝇、酵母和大肠杆菌的基因结构作充分分析的结果。

新的分子生物学方法也给群体生物学和生物进化的研究带来大发现。对微生物重要组群的进化关系的认识以及猩猩与人类在500万年前有一个共同的祖先的发现就是许多成就中的一个较好的例子。

尽管这些发现具有重要的意义，但是当考虑到世界整个生物圈时，分子生物学方法仅提供了很少的资料，仅有少量的个体和生物种用这种途径作过研究，核－酸序列资料的应用在生物学的许多领域还受到限制。

有三个观察结果可以证明这种倾向。第一，分子生物学技术的研制者们对生物多样性问题并不特别感兴趣；第二，重组DNA技术对受过生化系统训练的人来说是很容易操作的；第三，这些技术费时费力，因此对大量个体或种的资料就需要特别努力、即使是那些训练有素的人也是这样。虽然生物学的许多领域都认生物体的遗传变异图谱的知识中获益匪浅，但是，基因克隆和基因结构研究的标准程序并不能容易地应用到对大量的生物进行特征研究和比性研究中去。

本文我们将介绍一个称之为聚合酶链反应（PCR）的新技术，它能代替分子生物学中某些费时的方法。我们还要讨论该方法背后的理论，说明如何用它来阐明许多生物学问题。该技术对生物学的各个领域特别是分子遗传学、人类遗传学、法医学、发育生物学，传染病诊断以及癌症研究已经产生了具有重要意义的影响。我们将着重强调这种技术是如何对生物分类学、群体生物学、物种保护、生态学、环境科学和实验遗传学作出贡献的。

技 术

聚合酶链反应由美国Cetus公司率先研制成功，采用的是在体外的酶促DNA扩增，通过将一个选择DNA顺序合成其许多拷贝，PCR能够极大埤增加这个目标DNA，片段的数量0 PCR由许多个独立的扩增循环所组成，从原理上来看，每一个扩增循环都会使目标DNA的数量加倍，所以目标DNA呈指数扩增，也就是说，经过n次扩增，就会有2n倍的目标DNA产生。非目标性顺序并不值得扩增，这样，PCR就与无细胞体系或体外克隆方法连系起来。

PCR能够补充或超过许多传统的重组DNA的克隆方法，该技术的新的应用现在使先前不可能进行的研究能够进行。该法的简便易行性敏感性和多样性使得它能较好地适应于对大群体和各种植物、动物和微生物组群的研究。

扩增过程

首先选择一个有待扩增的目标DNA序列（图1a）。目标DNA的核苷酸序列可以不知道，但是，DNA两端任一端的短序列必须知道。利用这些序列来设计两个寡聚核苷酸引物，这些引物是单链DNA，银一个通常为20个核苷酸，引物是用DNA自动合成仪合成的，特异引物可以从有关公司定购。

引物的设计原理是，每对引物中一个引物的核苷酸序列要与目标DNA的侧翼顺序之一相互补，而另一个引物与另一个侧翼顺序互补。这样，在双链的目标DNA变性成为单链后，引物就会与目标基因的侧翼互补顺序相杂交（图1b）。引物的定向是使它们在与侧翼顺序结合时其轻基末端会面对目标顺序，其后加入DNA聚合酶。由于DNA聚合酶是通过使每一个链的3/末端加上脱氧核糖核苷三磷酸来扩展DNA链的，从而使目标DNA得到复制，所以，每一个引物的延长产物长到足以使它们包括与另一个引物互补的序列。

这一系列步骤——DNA变性、引物杂交、DNA聚合酶延长——代表一个PCR循环。这三个步骤中的任何一步都必须在合适的温度条件中完成（图2a）如果第一个循环后接第二个循环，那么就会得到目标顺序的许多拷贝。这个程序的主产物是一个在长度上完全与两个引物和目标DNA的长度之和相等的DNA片段。由于目标DNA的数量在每一个循环后就加倍，所以，经过20次循环就会得到起始目标DNA的近一万倍的拷贝。与引物进行非特异性退火并得到延长的非目标顺序的浓度经过20个循环后也会增加20倍。

特异性

虽然PCR的理论比较简单，但也还存在一些重要的问题，哺乳类基因组包含超过109个核苷酸，一个1000碱基对的目标片断仅仅代表着10-6到10-7的可以得到的DNA，在这些复杂的模板中，引物与许多非目标顺序的退火，即使是很少发生，也可能会降低最终产物中目标顺序的纯度。不完整的退火和延长的程度与引物退火和多聚酶延长步骤进行时的温度有关，因引物退火的特异性在较高温度中要高一些。在最早的实验中利用的是大肠杆菌的DNA聚合酶，该酶的最适反应温度为37°C，但经常会产生不很纯的目标产物，最近分离到一种抗高温型的DNA多聚酶（Taq酶），使得退火能在一种逐渐升高的温度中进行，这样就降低了非目标性顺序退火的频率，还增加了选择性，现在使得研究者们能得到大量很纯的目标DNA以进行其性质的研究。

分 析

一旦获得产物，就可以用多种方法对其进行分析，究竟采用何种方法这要依赖于所要解答的生物学问题。一个基因的等位状态可以用限制性酶（典型的是限制性片断长度多态性RFLP研究）对这个稳定基因的扩增DNA的酶切图谱来确定。由于DNA产物的纯度很高，所以生物学家们能够在酶消解和凝胶电泳以后对DNA片断直接加以染色而不要使用放射性标记的探针。

不同碱基替代但并不改变限制性内切酶识别位点的产物的等位状态可以通过利用等位特异性的寡巨核苷酸探针来确定。在合适的DNA杂交条件中，这些短DNA片段能够在二个实际相同的DNA顺序之间识别出单个碱基的差异。探针可以用放射性或非放射性报道分子来标记。

利用PCR产物以获得一个基因的完整的核苷酸顺序或许是PCR技术的最有效地应用。在PCR技术发展以前，为了确定一个先前未曾用分子生物学技术研究过的物种的一个基因的核苷酸顺序需要做大量的克隆工作，在最好的情况下，这种工作要花费好几个月的时间，即使基因在进化过程中非常保守以至于它能与从一个相关物种中获得的DNA探针结合。为了从那个物种的大量个体中克隆出相同基因的拷贝，就可能需要对每一个个体进行同样的费时费力地工作，在取得DNA克隆以后才开始DNA顺序分析。与此截然不同的是，利用PCR，生物学家们现在能在1到几天的时间里从几百个个体内制备出相当纯的DNA样品用于DNA序列分析工作。开始所用的目标DNA的量可以非常少，DNA也可以是不纯的或降解过的。例如，如果从一个哺乳类得到1μg DNA样品，要产生为序列分析所需要的1个500碱基对的DNA片断的数量仅仅需要进行25个扩增循环。利用各种设计精巧的简单的自动扩增仪可以同时进行96个样品的扩增，每一个扩增循环只需要大约3分钟，所以在几乎不到1个半小时就可以制备100个样品。PCR产物的纯度很高，所以不需要额外的实验步骤就可以直接测序。

在某些情况下，例如在二倍体物种和基因为高度多态性的物种中，期望的是逐个观察每个等位基因，因为存在于一个个体中的两个等位基因在PCR中都被扩增，所以要获得它们各目的序列经常需要对扩增DNA进行克隆，每个等位基因的几个克隆都必须测序，以便能保证所观察到的在克隆之间的差异是等位性变异的结果，而并不是由于DNA聚合酶的错误掺入。DNA聚合酶在引物延长步骤中可以引入较低水平的碱基对替代。与从生物体的完整DNA开始克隆基因相比较，PCR所提供的富集使得这种等位分析既容易又快速。

最后，对具有大基因组（大于109碱基对）的物种来说，标准的克隆方法可能需要几百μg的起始DNA，而用PCR产生纯的扩增DNA仅需要几沙克的起始DNA，甚至一个细胞内的DNA就可以进行分析。

然而，PCR的极端灵敏性是一个两刃剑，必须特别注意样品的污染，因为，只要少量的污染分子存在就可能会显著影响到由少量目标DNA分子所产生的PCR样品。尤其需要注意的是尽可能避免从先前试验中所得到的扩增DNA产物的污染。

除了只需要少量DNA用于分析以外，PCR还不需要标准的克隆以及DNA分析的程序，这些技术程序大多需要完整的DNA分子。这个因素解释了PCR技术在扩增古老DNA分子中获得成功的奥秘。已降解的DNA也完全适合于用作扩增小DNA片断的底物，因为在一个样品中分子的小片断就如同期望产物一样大。

结 论

PCR具有许多可能导致其快速应用的优点。对获得有关DNA序列的信息来说，这是一种在概念和操作上都很简单的方法，因此，也就很容易为那些非分子生物学家的各类专家们所接受。

与蛋白质电泳相比较，PCR仅需要稍多一点的实验设备，因此起动费用并不高。每个样品的扩增所需要的试剂和劳动力的用费也是适度的，所以该技术可以提供给那些非生物医学学术团体会员的研究者们使用。在需要考虑到获得及其转运用于现代技术来进行分析的冰冻样品的费用和困难问题时，PNA扩增用于群体研究的费用小的优点就变得更有意义。

利用PCR从传统的哺乳动物和鸟的皮肤，干燥的植物标本材料、湿法保存的生物体获取DNA序列资料的潜在能力极大地提高了现存博物馆收藏物作为有价值的生物学资料库的价值，可以利用这些遗传学资料在野外监测物种状况中帮助鉴别个体；路边死难者的脱发、一块皮肤都可以用作样品，因此并不一定需要活的动物材料。

PCR提供了一种能从一个群体（包括稀有的甚至已灭绝的生物）内的大量种和个体中快速获得DNA序列资料的简单技术，广泛的遗传分析以前所未见的细节，为观察更完整的微生物、植物和动物的进化变化的画面提供了机会。

[Bio Science，1990年第40卷第3期]