乔治 · 丘奇再次尝试创新，力求通过多重基因编辑来创建抗病毒细胞，提高器官移植成功率并保护大象。
在哈佛大学朗伍德校区，合成生物学家兼遗传学家乔治 · 丘奇（George Church）十分忙碌，不是指导学生构建最新的生物技术原型，就是与老伙伴一起开拓新领域。
丘奇一直被视为生物工程领域的开拓者。他在直接基因组测序和人类基因组计划等方面的工作备受赞誉；他与他的学生对CRISPR-Cas9系统编辑人类细胞能力的证明更是引起了大众关注。眼下，丘奇团队正努力开展的项目有望推动基因编辑进入一个全新层次，对整个科学界产生重大影响。
用丘奇自己的话说：“我们实验室正处于曲线的极点上，只需几年，我们就会看到无限的可能。”
这个神奇的极点就是多重基因编辑（multiplex genome editing）。丘奇实验室的合成生物学家们正关注几个独特的全基因组多重编辑应用案例。
多重工具箱
过去几十年间，基因编辑已从科幻跃入现实。这一变革很大程度归功于基于CRISPR的技术以及其他顶尖创新。鲁道夫 · 巴兰古（Rodolphe Barrangou）是北卡罗来纳州立大学CRISPR实验室负责人，也是最早从嗜热链球菌基因组中发现CRISPR重复区域的人之一。他的团队意识到Cas9酶会导致一种适应性免疫；他们展示了细菌如何存储、识别和共享有关病毒病原体的信息。巴兰古表示，CRISPR最初只是一种筛选耐噬菌体细菌的自然方法。
巴兰古等学者于细微处收获的关键发现后来演变为功能丰富的CRISPR魔剪。用一句话简介CRISPR编辑就是，Cas9酶由向导RNA（gRNA）引领，二者合力剪掉DNA的一部分，以删除或插入新信息。如今，CRISPR的能力远不止于此，它还可以使用失活形式的Cas蛋白激活或抑制基因——无须剪切；其他的进步包括碱基编辑——使用Cas蛋白一次编辑一个碱基，在DNA的单条链上形成一个小切口。
然而，基因编辑领域仍面临一个巨大挑战，那就是研究人员只能在某一处进行一次编辑。许多疾病本质上由多基因控制；应对气候变化和工业生物工程的复杂问题时，改造生物体一两个基因也完全不够用。几十年来，人们不断寻找多基因编辑技术，或是一套可解决复杂多基因变化的工具。
随着CRISPR成为首选基因编辑工具，丘奇和他的学生开始研究如何扩展这一工具以及其他新型生物技术的规模。多重编辑的目标是同时修改基因组的多处位置——数十、数百甚至数千个碱基。丘奇发现多基因编辑的最大障碍不是功效，而是安全性，“精确编辑独特的序列并确保没有任何严重偏离目标的内容是另一回事”。
MAGE系统的几个循环可以将经过编辑的遗传信息片段引入基因组中的多个靶点，促进集落中不同细胞群的生长，或交换多肽链中的氨基酸
脱靶效应包括编辑目标附近基因（未经修改）的错误表型表达，或多次编辑后基因组的大规模功能障碍。举个例子，CRISPR技术虽然对于编辑从细菌到人类的任何生命体都非常有用且高效，但也可能产生毒性危害机体，尤其是用于治疗的CRISPR.
2009年，丘奇和他以前的几位学生开发了一种被称为多重自动化基因组工程（MAGE）的系统。该系统可在DNA不出现双链断裂的情况下进行多次编辑，而双链断裂可能导致CRISPR结果不佳。同源重组现象发生于细胞分裂和DNA修复的过程中，是指核苷酸序列在相似染色体或基因之间交叉重组。MAGE系统允许各种细胞群通过同源重组方式的基因编辑来生长。这一编辑技术有时也称“重组工程”。MAGE系统早期使用的工具来自一种叫作Redβ的λ噬菌体蛋白——其更广为人知的名字是单链退火蛋白（SSAP）。
虽然CRISPR系统能编辑许多不同生物体的基因，但一些基因组工程技术的可用与否，往往受物种限制。过去几十年间，SSAP仅被用于大肠杆菌等细菌。SSAP来自λ噬菌体，后者很善于感染大肠杆菌，并利用宿主的结合蛋白将自己基因嵌入到宿主基因组中。基因编辑者会把SSAP加到包含编辑的寡核苷酸上。这条DNA链与解链DNA中的同源位置同步，SSAP从滞后链开始将两条链结合到一起。此过程很简单，类似于DNA复制过程中看到的冈崎片段。
作为MAGE系统的一部分，这个过程会随着与大肠杆菌基因组不同部分相匹配的基因编辑寡核苷酸的多次引入而重复发生。然后，技术人员将这些编辑引入细菌菌落，菌落里每个成员都能吸收、共享它们。丘奇表示，一个技术人员可以对几十处位点施用MAGE，于一天内制造40亿个不同的基因编辑细胞。
美国俄亥俄州立大学医学院的结构生物学家查尔斯 · 贝尔（Charles Bell）表示：“就多重编辑性质和效率而言，SSAP可能比CRISPR更强大。如果有一天我们能设计出一种对人类有效的东西，我认为在某些方面，MAGE可能更强大。”
SSAP与宿主现有的单链结合蛋白一起编辑DNA的单链部分。在复制过程中使用SSAP结合编辑基因会产生新一代编辑细胞，可利用MAGE系统扩大此生产过程
贝尔过去曾与丘奇合作，现在把重点放在SSAP上；他使用低温电子显微镜等技术来确定这些蛋白质的结构。在最近一项研究中，贝尔团队在不同噬菌体中发现了一种与λ Redβ结构同源的蛋白质，而且它看起来与一种发现于人类、名为RAD52的蛋白质非常相似。RAD52蛋白是人类DNA修复机制的一部分，它与单链DNA结合，从而使互补链退火。
贝尔表示：“我们可以使结构排列整齐，并证明有共同的核心折叠存在，因此我们的噬菌体蛋白结构有助于大家理解这一整体机制。这些工作强化论证了噬菌体蛋白和人类RAD52之间的联系。”
贝尔等人的发现可能是开发供人类使用的多重编辑SSAP的下一步。但在此之前，丘奇和其他学者正在将多重编辑技术与经过验证的工具相结合。例如，丘奇团队已证明，碱基编辑可以同时编辑人类干细胞的33个必需基因。CRISPR编辑能在全基因组范围内发挥作用（无论脱靶效应如何），以获得药物开发所需的化合物，例如通过哺乳动物细胞生产抗凝血剂肝素（无须再从猪身上提取）。更多研究表明，SSAP可助力CRISPR的双链断裂修复系统，减少不良影响，从而有望改进单基因和多基因编辑。
巴兰古认为，对于许多应用，多重CRISPR编辑都是安全且完全可行的——这将极大助益生物设计，使合成生物学界能在基因组编辑领域实现下一个飞跃。巴兰古说道：“想想合成生物学时代的‘类固醇基因组编辑’。”他说。在生物工程方面，更多多重编辑的奇特应用案例正在冒出来。
保护我们的微生物工厂
自MAGE系统开发以来，丘奇团队以多种特殊方式使用了它。利用MAGE来保护细菌免受病毒侵害，可以说是该团队最基础的研究领域之一。
2013年，丘奇和他的学生对大肠杆菌基因组做了个微小调整，从而修改转运RNA（tRNA）将氨基酸传递和安装至肽链上的方式。这个经过320多次编辑的初始“重新编码”菌株可以毫无障碍地合成自己的蛋白质；而试图入侵细菌的噬菌体无法复制并感染宿主。这是对基因编辑菌株抵抗病毒甚至质粒等可移动遗传元件的能力的首次证明。
丘奇实验室的合成生物学家阿科斯 · 尼尔格斯（Akos Nyerges）2022年主导完成了一项研究：他们再次改变大肠杆菌的遗传密码，得到更强健的菌株，名为Ec_Syn61Δ3-SL，可防止噬菌体劫持其基因组翻译机制来复制病毒蛋白，还拥有其他自保手段。
尼尔格斯仔细观察了旧版改造后的大肠杆菌基因组，找到一些密码子，并使用重编程的tRNA去重新编码它们。编码丝氨酸的两个密码子被修改，结果丝氨酸成了亮氨酸。一个终止密码子被重新设计，从而引入一种不存在于任何生命系统中的氨基酸，名为“非标准氨基酸”（nsAA）。基因组的这三处变化使Ec_Syn61Δ3-SL的生命代码保持稳定，同时能够错误翻译任何试图入侵的病毒，从而自保周全。
相比于大约十年前的早期尝试，尼尔格斯的新版改良大肠杆菌，对所有测试中的入侵者都表现出抵抗力——自然，它防御新型病毒的水平会比前辈强不少。尼尔格斯与同事发现了12种新的噬菌体菌株，它们能很轻易感染旧版改良大肠杆菌，却奈何不了新版。研究团队从各个地方，包括污水、河流和农业土壤等，都分离出了这些噬菌体。尼尔吉斯说道：“这次采样表明病毒基因组具备许多未开发的功能。从系统发育层面看，这些噬菌体与人们早就在工业感染中发现的噬菌体相似，但它们并不专门针对实验室记录的生物体；因此，它们的一些近亲可能是工业发酵和实验室感染中的麻烦制造者。”
尼尔吉斯团队欣喜若狂，因为这种重新编码创造了一个抵御感染的安全“防火墙”，尤其令人兴奋的是，Ec_Syn61Δ3-SL的防火墙超越了实验室或其他设施抵御病原体等生物危害的方式——这是一种分子水平上的生物防护。
尼尔吉斯表示，针对基因重新编码的细胞做生物防护是有益的，他们不希望出现细胞意外逃逸和修改基因的扩散——尽管这种情况发生概率极低。前文提到的非标准氨基酸（nsAA）是关键的安全措施，可防止新的大肠杆菌菌株扩散到野外。丘奇指出：“如果你制造出一种具备多种病毒抗性的生物体，它就会是为数不多的能于野外存活超过几分钟的实验室生物体。大多数实验室生物体都非常脆弱，相较野生型没什么竞争力，但你可以想见，一种健康到足以用于生产并且对所有病毒具备抵抗力的生物体，将在野外拥有巨大生存优势。”
在迈克尔 · 克莱顿（Michael Crichton）创作的《侏罗纪公园》中，遗传学家亨利 · 吴博士对恐龙基因组进行了一种所谓“赖氨酸应急”的改造。这种改造消除了恐龙自主生产赖氨酸的能力，从而迫使其必须依赖人类提供的赖氨酸补充剂，无法逃离公园。根据丘奇的说法，这就是一种生物防护形式，但它不够精准。“我们想采取《侏罗纪公园》的方式，但要做得正确。”
丘奇表示，噬菌体需要进行数百次改变才能克服Ec_Syn61Δ3-SL中的大规模编辑，因此这是真正的保护。丘奇实验室和世界各地其他实验室的目标是让这种生物防护适用于可持续的微生物基因编辑，应用于生物治理或生物燃料等行业，甚至是旨在疾病治疗的人类基因组编辑。
大规模编辑的极大吸引力
尼尔吉斯表示，抵御病毒、具备生物防护的改良大肠杆菌是一个关键起点，“广阔天地大有作为，无论是耐病毒属性还是作为一个整体的MAGE系统，都将给其他领域带去更大可能”。
丘奇认为，这项工作能很好地转化应用于异种移植——这是他实验室的另一项重大研究。2022年初，一名来自美国马里兰州的57岁男子接受了猪心脏移植手术，将生命延长了近两个月。最终导致他死亡的并非排异反应，而是一种仅在猪体内发现的疱疹病毒。丘奇和他以前的学生、现在领导启函生物技术公司的杨璐菡创立了eGenesis，旨在解决此类异种移植的风险。
丘奇和杨璐菡使用肾细胞，靶向62份猪内源性逆转录病毒（PERV）拷贝；这些病毒拷贝嵌入了猪的基因组中。对于猪来说，PERV无害；但研究人员不确定它们对人类有多大危害。丘奇和杨璐菡研究了这些元素，并使用多重CRISPR-Cas9系统灭活了62个病毒基因拷贝，从而将PERV从猪细胞到人类细胞的传播减少到低于1‰。这一概念验证或可引领我们最终生产出可用的哺乳动物细胞或用于治疗的移植物。
与PERV一样，人类基因组中也遍布内源性逆转录病毒和其他重复元素。这些重复区域曾被视为“垃圾DNA”，但现在研究表明，它们甚至能破坏基因表达、引发疾病并影响衰老过程。丘奇表示：“从本质上说，我们研究的是人类基因组中每一类主要重复序列，其中一些重复序列的数量以百万计。”他的实验室以多重编辑技术作为首要技术，研究了24 000个重复元素。
除了生物医学应用外，丘奇也正试图将多重编辑工程带入现实世界的侏罗纪公园。他创办的克罗索生命科学公司致力于复活已灭绝的猛犸象和塔斯马尼亚虎，并保护世界上最庞大的生态系统“工程师”之一：大象。
即便多重基因编辑无法像CRISPR技术那样掀起波澜，丘奇也希望，至少这种新技术能像他自己的实验室那样激发一连串灵感。丘奇说道：“我们为改进多重编辑所做的一切，包括对细菌的多重编辑，都影响了我们在哺乳动物细胞方面的工作。我们在人类干细胞方面所做的一切，都使大象保护项目受益。通过多重编辑，这些领域可以产生一些协同作用。”
资料来源 The Scientist