借助定向演化的力量，科学家距离开发能穿越人类血脑屏障以提供基因治疗的病毒载体又近了一步。
血脑屏障（BBB）是调控物质进出大脑的细胞堡垒。它确保大脑能够获取关键营养物质，同时保护其免受病原体和毒素侵害。另一方面，血脑屏障却也阻碍了许多有潜力的治疗方法。不过眼下，基因递送载体系统升级换代，有望很快带来高效疗法。
科学家正在研究脂质纳米颗粒和其他递送载体，但腺相关病毒（AAV）载体因其靶向能力超强，能在非分裂细胞内持久表达而对人类无致病性，仍是较好的体内基因治疗递送平台。
美国宾夕法尼亚大学基因和细胞疗法研究员贝弗利 · 戴维森（Beverly Davidson）表示：“可以肯定地说，如果我们能将AAV送达目的地，那么这就是种一劳永逸的疗法。”
越来越多基于AAV的基因疗法获批，还有数百种正在临床研发中。然而，许多为治疗中枢神经系统疾病而开发的疗法需要侵入性措施，包括直接注射大脑或腰椎穿刺，这也会限制疗法作用的范围。
美国加州理工学院神经科学家维维安娜 · 格拉迪纳鲁（Viviana Gradinaru）表示：“理论上，脉管系统将是最适合疗法输送的‘高速公路’，原因很简单，人脑有600多公里长的脉管系统。”这个广泛分布的动脉网络为大脑近1000亿个神经元提供服务，但要沿着大脑的脉管高速公路行进，静脉注射的AAV必须穿过血脑屏障的边界管制。我们如果了解这个高度选择性门户的规律，就能从该基本生物学原理中获益，让疗法进入大脑。
维维安娜·格拉迪纳鲁设计了腺相关病毒，用于全脑范围基因治疗以及相关基础研究应用
过去十年间，在规律还没有揭示的情况下，格拉迪纳鲁领衔的团队开发了以驱动基因疗法传递至大脑的AAV工程策略。
载体选择
腺相关病毒的两大基本组成是病毒DNA及其蛋白质外壳（又称衣壳）。为将病毒转化为基因疗法，科学家用需要递送的基因替换病毒的DNA，并控制基因表达。科学家已经确定许多遗传性疾病的遗传原因，不过明确所需基因是一方面，安全递送基因货物是另一方面——这方面工作难度很大，其关键在于病毒衣壳。除了保护病毒携带的基因组，这种二十面体结构的笼形蛋白还决定着病毒通过与细胞表面受体的相互作用进入哪些组织和细胞。科学家已经发现了13种天然存在的AAV血清型，许多血清型都能以不同效率感染脑细胞，不过只有AAV9和AAVrh.10（较少被研究）能穿过血脑屏障。
脊髓性肌萎缩基因疗法Zolgensma由诺华制药研发——一种在两岁以下儿童中取得巨大成功、已获美国食品药品管理局（FDA）批准的AAV9疗法——能从根本上治疗脊髓性肌萎缩症。然而，AAV9并非科学家理想中的中枢神经系统靶向基因治疗的万能平台。大脑发育的变化伴随病毒对不同细胞类型倾向性的变化。一项非临床研究表明，虽然该病毒能穿过血脑屏障，但它优先靶向新生小鼠的神经元和成年小鼠的星形胶质细胞。
鉴于上述变化，给儿童用的剂量对成年人来说就只能影响大脑神经元的一小部分，而增加剂量又会超出安全极限。尤其令人担忧的是该病毒对肝脏的偏爱。
美国博德研究所分子生物学家本 · 德弗曼（Ben Deverman）指出：“你如果查看以该剂量传递给单个肝细胞的载体基因组数量，就会发现每个细胞对应数百个病毒基因组，但平均而言，给大脑的递送量远少于每个细胞携带一个病毒基因组的水平。”
本·德弗曼将定向演化与高通量体外结合实验相结合，设计和筛选大脑特异性的新型AAV
为提高递送水平，同时使AAV远离脆弱区域而直指目标器官或细胞，德弗曼、格拉迪纳鲁和戴维森等科学家开发了病毒衣壳工程策略，促使新的AAV模型投入生产线。
创建衣壳
衣壳工程有两种主要方法。格拉迪纳鲁表示：“如果了解规律，就可以根据规律进行设计。”对血脑屏障上特定受体的了解，令科学家能通过合理设计编辑衣壳，但科学家只识别出了其中的几个。
十多年前，格拉迪纳鲁认为，在不了解规律的情况下，设计AAV的最佳方式是利用一种机制未知的方法。这一工程解决方案的灵感来自她与同事弗朗西斯 · 阿诺德（Frances Arnold）的交流，后者曾凭借在酶的定向演化方面的工作而获得诺贝尔奖。
格拉迪纳鲁说道：“我们意识到，定向演化可以解决衣壳方面的问题，因为你无须理解其生物学规律即能取得进展。”但这方面工作离不开一个理想的模板和严格的选择标准。
格拉迪纳鲁团队的第一步就是聚焦AAV9。
当病原体与宿主相互作用时，它通过演化提高自身毒力、靶向能力和生存能力。宿主数量越多，病原体就有更多演化机会，不断出现的SARS-CoV-2变体就证明了这一点。格拉迪纳鲁指出：“这正是被我们运用于AAV9工作的经验。”研究人员发现，他们可以利用定向演化，通过重复生成、测试和选择表现出特定特征（例如增强的靶向能力）的病毒载体来加快进化过程。
2010年代初，德弗曼作为博士后加入了加州理工学院格拉迪纳鲁团队，并在那里开发出一条用于创建和测试新型AAV的管线。为创制新衣壳库，德弗曼编辑了AAV基因组的一部分，其中包含一段7个氨基酸的序列，他发现这些氨基酸能在稍作改变后仍形成衣壳。通过编辑这一微小病毒结构，德弗曼和同事产出许多衣壳并进行测试。用德弗曼的话说，借助蛋白质工程，“可能创建得到的衣壳数量多过宇宙中的恒星数，虽然其中大多数无法形成衣壳，但最后成功的小部分依然数量庞大，我们永远测试不完”。
研究团队选择了那些能最有效地将基因货物递送至大脑的理想衣壳。为针对性地选出能成功穿过血脑屏障的病毒，德弗曼将衣壳库注射到Cre转基因小鼠中，从它们脑组织中分离出DNA，接着对成功感染Cre表达细胞的病毒基因组进行测序，然后使用这些序列生成第二个衣壳库，用于另一轮测试。该管线产出了多种病毒变体，但德弗曼和同事决定推进其中最成功的AAV-PHP.B，将其与AAV9作直接对比。在该实验中，他们将绿色荧光蛋白加载到每种病毒中，再通过静脉注射施予小鼠，然后比较绿色荧光蛋白分子在大脑中的递送效率。结果显示，AAV-PHP.B的基因转移效益比标准AAV9高至少40倍。
德弗曼表示：“这让大家对AAV-PHP.B的潜力充满兴趣。”团队其他研究人员继续开发工程化AAV——其向大脑递送基因的效率比标准AAV提高400倍。
格拉迪纳鲁表示：“上述工作是我们在不了解机制的情况下设计AAV的第一章。”此外，他们还完成了AAV工程的另外几个章节。不过难题也随之而来。
物种特异性
当其他科学家开始使用这种新衣壳时，一个关键发现引起关注。实验显示，AAV-PHP.B在狨猴和恒河猴等非人灵长类动物体内的递送效率有限，这表明衣壳与血脑屏障相互作用的方式存在潜在物种差异。此外，衣壳的高效率似乎只在C57BL/6J品系实验小鼠身上展现。
德弗曼团队和其他学者利用上述差异探究了工程AAV在C57BL/6J小鼠品系中穿过血脑屏障的机制，并发现一种新受体，即淋巴细胞抗原6家族成员A（LY6A）。由此可知，缺乏功能性LY6A的物种将表现出有限的AAV-PHP.B表达（如果有的话）。
非人灵长类动物体在演化层面与人类相似，因此是测试疗法的理想模型。然而，实验用的非人灵长类动物供应少、成本高，选择过程需深思熟虑。当格拉迪纳鲁开始在非人灵长类动物身上测试病毒载体时，她仍需依赖AAV在小鼠中的定向演化。
格拉迪纳鲁想跳过小鼠这个中间环节，从生成衣壳库直接迈向测试非人灵长类动物体内的工程变体，这就需要运用新方法。由于目前无法获得Cre转基因狨猴，因此无法使用类似的Cre驱动非人灵长类动物系统产生选择压力。于是她的团队使用从成功进入大脑的病毒变体中收集到的下一代测序数据来构建递送网络。他们得到了最高效的衣壳，但并未只选择它们进行第二轮测试，因为这类衣壳进入大脑的机制可能只适用于狨猴。在第二轮围绕新生恒河猴（2500万年前与人类分离）的测试中，研究团队选用了多种AAV开展工作。
最后AAV.CAP-Mac脱颖而出。格拉迪纳鲁等人改进此变体，并在多种灵长类动物和培养的人类神经元中做进一步测试，结果显示它在整个大脑范围内的基因传递效率更高。
上述关于非人灵长类动物的研究使AAV测试离人类更近，也证明可以有倾向性地引导AAV进入大脑。格拉迪纳鲁团队仅改变肽序列中的一两个氨基酸，就使得AAV偏向内皮细胞或神经元而非肝脏。研究人员能通过提高特异性来降低剂量并减少脱靶毒性。
戴维森说道：“在我看来，真正的障碍在于，怎样使它们完全不会靶向大脑以外的器官。”
道路规则
虽然机制未知，科学家已生成数千种新的AAV，它们在全身范围内表现出不同的基因递送特征。格拉迪纳鲁说道：“我们可以利用这些AAV库来探究作用机制，这是该领域前所未有的机会。”
德弗曼将关于小鼠大脑中LY6A门户的发现称作自己团队的转折点。“要知道我们设计的AAV穿越血脑屏障时的效率比AAV9高100倍以上，但我们不知道为什么。”在得到新发现之前，德弗曼等人不确定他们设计的衣壳是使用了与AAV9相同的受体而更好，还是能够结合一个完全不同的受体导致。LY6A的发现表明，在针对衣壳开展耗时且烧钱的体内实验前，他们能测试工程化AAV结合特定已知蛋白质的能力。
德弗曼和同事最近将这一概念转化为高通量蛋白质检测。为了选择与LY6A结合的衣壳，他们将大型AAV库与附着于纯化蛋白上的磁珠悬浮液混合，并提取黏附于磁珠上的衣壳。结果如预期，他们确定了AAV-PHP.B家族的代表。德弗曼预测，他们可以使用这种方法从新靶点开发衣壳。为测试这一点，他们为LY6家族成员C1（LY6C1，所有小鼠品系中一致表达）开发了另一种蛋白珠制剂，并发现了数千个结合LY6C1的序列。当他们在小鼠身上进行测试时，数百个衣壳成功进入大脑并感染神经元和神经胶质细胞。德弗曼表示：“这太棒了，它确实超出了我们的预期。”
这种方法也比较灵敏。通过体内筛选，研究人员将数千个衣壳变体丢向大脑，然后收回通过血脑屏障的衣壳。但德弗曼也指出，现阶段AAV库过于多样化，很难收回每个AAV，而这就会限制重现性。
德弗曼表示：“如果将相同的AAV库放入三只小鼠，就可从每只小鼠处获得10 000个独特序列，且几乎没有重叠，因为你是从数千万个衣壳中进行采样和抓取的。”
通过更新的方法，研究团队不断收到具有更大多样性的衣壳，然后使用这些序列来训练生成机器学习模型，从而预测更多具有相同功能的序列。德弗曼表示：“进入第二轮筛选后，我们已经可以使序列成熟，并探索比第一轮更多的内容。”
格拉迪纳鲁还使用新的计算和蛋白质结构预测工具来发现新型AAV。在探究某些具备增强大脑表达的AAV变体穿过血脑屏障的机制时，两个目标突然出现：已经确定的LY6C1和另一个更不寻常的蛋白——碳酸酐酶IV（CA-IV）。
格拉迪纳鲁说道：“碳酸酐酶IV是人体所拥有的一种酶，在血脑屏障处含量丰富，能调节血液pH值。此外，它在演化上是保守的——老鼠有它，人类也有。”
酶上有一些位点是完全保守的，另一些位点则有显著的序列修饰，因此根据工程化AAV的具体结合位置，它可能在不同物种之间产生相似或不同的效应。格拉迪纳鲁团队想通过更先进的方法让工程化AAV更具靶向性，于是转向AlphaFold——一款基于人工智能的蛋白质折叠预测工具。为此，他们让AlphaFold学习碳酸酐酶IV结合袋（binding pocket）以及工程化AAV中发现的肽。
格拉迪纳鲁说道：“AlphaFold告诉我们哪些药物可以在啮齿类动物、猕猴中发挥作用，而无须在人体中进行测试。”
考虑到物种特异性的潜力，在非人灵长类动物中演化的AAV可能无法在人类中很好地发挥作用。格拉迪纳鲁的AlphaFold预测工具和德弗曼的体外结合实验等方法可提供信息，帮助我们开发更多人类特异性基因递送载体和可穿过大脑的生物制剂。
科学家正更深入理解健康和病变的脑血管系统，而这可能为新型AAV衣壳的机制选择提供新的靶点。此外，进入大脑只是一个障碍。科学家可以进一步设计穿越血脑屏障的衣壳以满足各种靶向需求——只要衣壳在大脑内移动，就能实现更大特异性。
德弗曼说道：“在接下来几年里，该领域将学到很多关于何种类型受体能介导AAV胞移作用的知识。我觉得我们即将取得一些重大进展。”
许多尚无有效疗法的脑部疾病，包括神经退行性疾病、神经肌肉疾病和溶酶体贮积病，皆可受益于载体工程的进步。
资料来源 The Scientist
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本文作者丹妮尔·格哈德（Danielle Gerhard）博士在耶鲁大学获得心理学和行为神经科学博士学位，并在威尔康奈尔医学院担任神经科学和精神病学博士后研究职位