CRISPR可能是首个有望颠覆天然基因组、消除遗传疾病的基因编辑成果。但从一开始，就有一道难题摆在面前：准确性。

早在2017年，一份报告因使用CRISPR技术而充满争议：因为在小鼠身上发现了大量脱靶的编辑，基因编辑工具肆意地剪切了无辜的基因。这项研究遭到了强烈的驳斥，并最终被撤回，但人们对这种强大工具的脱靶问题的担忧并没有消失。即使相对准确的CRISPR替代版本，最近也因为其在DNA和RNA中引起数百个意想不到的突变而饱受争议。

如果不能确保精准性，任何已提出的CRISPR基因治疗都将沦为“掷骰子”行为。

现在，来自杜克大学的一个团队可能已经开发了一个通用的解决方案：能从根本上提高几乎所有形式的CRISPR准确性——微调了向导RNA。向导RNA是CRISPR两个组成中不可或缺的组分，发挥着类似“侦探猎犬”的作用，它能在其合作伙伴Cas对特定DNA序列进行切割前瞄准好待修改的序列。该项研究于近期发表在《自然﹣生物技术》杂志上。

如何微调？将一种“锁定”结构标记到向导RNA的一端，这样只有靶标DNA才能激活Cas施展“剪刀”功能。然而，正是因为这个微调如此简单，向导RNA 2.0可以从根本上提高多个CRISPR系统的准确性，甚至高达200倍。这样的微调，不仅对那些依赖经典Cas9的系统有效，同样也对依赖Cas12a及其他新型剪切系统有效。

这并不是增量调整。相反，这一调整策略与以往为提高CRISPR准确度所作的努力截然不同，以往常致力于寻找新的、更好版本的Cas剪刀。

“我们所关注的解决方案，它不会增加更多的部件，而且能够适用于任何一种CRISPR系统。”研究报告的作者杜兰·寇卡科（Dewran Kocak）说。

“这是一个相当不错的、简洁的、可以杜绝脱靶现象的解决方案。”第一作者查尔斯·格斯巴赫（Charles Gersbach）博士补充说。

你好，我是向导RNA

为什么改变分子侦探猎犬能从根本上提高CRISPR编辑的准确性？

回溯历史，RNA结构的变化所发挥的作用不容忽视。例如，荣获了诺贝尔奖的基因沉默技术（RNAi）花了数十年时间才得以揭示，对靶向RNA的微小调整可以大幅度减弱免疫应答或提高效率和准确性。

RNAi等来之不易的经验教训启发着基因编辑。当我们在描述CRISPR的过程时，通常都是这么说的：向导RNA——长得像一条蠕虫似的——包含与靶标DNA匹配的字母序列。当这二者结合时，会遵循严格的配对规则，即A与T*结合，C与G结合，之后向导RNA将Cas剪刀拖过来，在预定的位置进行DNA剪切。（*更准确地说， DNA中是“T”， RNA中是“U”。）

不幸的是，在生物学中，理论往往与现实不符。事实上，向导RNA看起来就像很多片被串在一起的三叶草叶子，里面塞满了被称之为“茎环结构”（stem-loops）的突起，这使得它的结构稳定，结合效率最大化。总的来说，大多数向导RNA只包含20个左右的碱基。在人类浩如烟海约60亿个DNA碱基中，错配率相当高。

这就是为什么设计向导RNA既是一门科学也是一门艺术的部分原因。与尤达的著名格言“要么做要么不做，没有尝试这一说”不同，科学家们通常需要反复修改他们设计的特定向导RNA序列，才能使其正常工作。

尽管如此，CRISPR一直都有一本向导RNA工程设计指南——一种通用的原型设计，可适用于大多数的CRISPR应用程序。

一切都与能量有关

研究小组的灵感来自于细胞需要能量。

正如任何其他生物事件一样，向导RNA与DNA结合并释放Cas是需要能量的。之前的研究发现，向导RNA与DNA匹配得越精确，两者就越容易形成所谓的“R环”（一种启动了整个切割程序的分子杂交体）。

该团队的绝妙想法是在向导RNA的尾端添加一个额外的三叶草状结构。这种“发夹结构”（hairpin）在很多情况下就像一个实体块，除非向导RNA与靶标DNA匹配，否则它庞大的结构就会阻止RNA与DNA配对形成R环。无法形成R环，就不会发生切割，就能保证非靶标DNA序列的安全。但是，如果序列确实匹配的话，向导RNA就会与其相匹配的DNA形成R环，撕开发夹结构，这反过来会激发Cas剪刀行动。

该团队在计算机模拟技术的指导下，设计了一系列的携带发夹结构的向导RNA或称“hp-sgRNAs”，在人类细胞中进行了试验。当与经典的Cas9配对时，新型分子侦探猎犬的靶标特异性提升了大约50倍。在一项观察细胞基因组中脱靶效应的敏感实验中，研究小组发现，与经典的向导RNA相比，他们的升级版本减少了124个脱靶位点，且没有产生任何新的脱靶位点。

与它结合的Cas剪刀的效用一样令人印象深刻，其中许多剪刀在结构和功能上与Cas9仅有微弱的相似之处。然而，当携带发夹结构的向导RNA与Cas组合后，Cas12及其变体能够切割指定的DNA序列，其效率与和普通向导RNA组合时不相上下，但脱靶的情况要少得多。

此外，研究小组还发现，他们能够通过微调发夹的结构来微调Cas剪刀的效能。一个“更紧凑”的发夹能够使得锁定更加牢固，这虽然会降低编辑效率，但也大大提高了准确性。一个“宽松的”发夹结构有助于保持Cas的活性，但对准确性却没有什么帮助。

“通过观察R环的形成，我们能够预测发夹向导RNA的能量情况。”论文作者解释道。这种可预测性非常有价值——它能让未来的科学家更简易地校正发夹向导RNA和CRISPR系统的强度与准确性。

指南改变

这并不是科学家们第一次尝试提高CRISPR的准确性。

之前的一个想法是使CRISPR系统变成“铁三角”：一个向导RNA加两个Cas剪刀。要进行DNA切割，两个Cas必须都与相同的DNA序列相结合。虽然这是一个很巧妙的方法，但这个想法需要科学家们向细胞中输入更多的成分，从而给本已很敏感的生态系统增加更多的不确定性。

另一个想法就是瓦解Cas剪刀，使他们不太可能乱剪，当然这个想法也有其软肋。设计特定性质的蛋白质是极其困难和耗时的，科学家必须根据他们的需要定制每个Cas变体。

格斯巴赫解释说：“每次我们发现一种新的CRISPR蛋白，都要进行大规模的重新改造，使其更加精确，因此这并不是一个简易的解决方案。”

相比之下，杜克大学研究小组对向导RNA的探索，可能会从根本上改变今后CRISPR系统的设计。

“所有CRISPR系统都有向导RNA，这些短RNA更容易设计。” 寇卡科说道。

接下来，研究小组想进一步确认他们的发夹向导RNA替代品可以与其他已经在使用的Cas剪刀协同工作。他们还想要深入研究这种合作关系是如何运作的，并探索进一步提高靶向准确性的方法——不仅是在自由漂浮的细胞中，更重要的是，在患有遗传疾病的动物模型中。

资料来源 singularityhub.com