正如CRISPR基因组编辑技术的诞生时刻，科学家的好奇心和造福社会的愿望将会推动CRISPR技术未来十年的创新发展。
分子生物学、遗传学和基因组学正处于关键时刻——历史积累的知识和方法能够在技术上实现有效编辑细胞和活有机体DNA的特定碱基对或片段。一个新时代俨然到来：规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）基因编辑技术联合不断提升的计算机和成像水平，能够精确诊断疾病并基于个体基因组预测疾病易感性，甚至能够改造遗传信息。该技术同样能够鉴定和快速改造植物性状的基因，加快农业研究和植物育种的速度。技术的结合影响深远，而这一切仅仅是初露锋芒。在CRISPR-Cas9作为基因编辑技术诞生的十年中，CRISPR工具箱使生物学研究发生了天翻地覆的变化，在造福遗传病患者的同时，还改变了农业的运作方式和农产品。作为CRISPR技术应用的典范，基因组医学领域能够在24小时内获得人类基因组的完整序列——相比破解第一个人类基因组序列花费了五年，这一进步令人惊叹。在此之前，在基因组中设计并写入临床上有效的信息几乎是天方夜谭，而现在利用强大的CRISPR基因组编辑器只需要花费几天时间。
图1 CRISPR：过去、现在和未来 过去十年中，CRISPR技术主要用于建立基因敲除平台、制造基因敲除小鼠等动物模型、遗传筛选和多重基因编辑，CRISPR在医药和农业领域应用的发令枪已经响起，社会需求将在未来十年驱动CRISPR技术的进一步发展
过去十年中，RNA编程的基因组编辑技术横空出世，在许多领域中经基因工程设计并广泛应用。CRISPR-Cas9的基础功能是在基因或基因调控元件中敲除目标基因，科学家基于此搭建技术平台，实现快速制造基因敲除的小鼠和其他动物模型、遗传筛选和多重基因编辑。除了常规的CRISPR-Cas9诱导基因敲除外，碱基编辑则能够在位点生成特定而精确的点突变，利用基因工程设计的Cas9与酶融合改变了DNA碱基的化学本质。过去十年中，CRISPR技术已经在科学家手中成为适用性很高的工具，广泛用于研究生物功能、解析基因相互作用，以及对抗人类疾病和生产基因工程作物。本综述追溯CRISPR基因编辑技术从诞生到成功应用的发展历程，探讨目前面临的紧迫挑战，包括如何提升编辑的准确性和精确性、实现基因序列的精确可编程插入、促进CRISPR编辑器的靶向递送，以及增加技术的可得性和可负担性。我们讨论这些问题的现状，包括新兴的基因插入技术和全新的递送形式，描绘未来所需的创新和基因工程方向。本综述例证CRISPR基因组编辑器在医药和农业领域的广泛应用，包括基于CRISPR的镰状细胞病疗法、营养更好的CRISPR编辑番茄，以及产量高的CRISPR编辑抗病小麦，讨论CRISPR现状和未来的潜在社会影响。
未来十年，基因组编辑研究和应用的领域将会进一步拓展，与机器学习、活细胞成像和测序等技术进步相互交织。新发现将会拓展和优化CRISPR工具箱，以应对目前各种挑战，并在基础和应用研究中发挥广泛作用。正如CRISPR基因组编辑技术的诞生时刻，科学家的好奇心和造福社会的愿望将会推动CRISPR技术未来十年的创新发展。
本综述讨论CRISPR基因操纵技术在人类、动物和植物中应用的现状，聚焦该技术的成果和挑战，并展望未来技术路径。
这项技术的起点可以追溯到1987年，当时一篇文章报道了细菌基因组中的重复DNA序列，而一些微生物学和食品科学研究者开始对此展开研究。这一神秘的DNA序列被称作规律间隔成簇短回文重复序列，通常与编码CRISPR相关蛋白（Cas）的序列一同出现在微生物基因组中。研究者发现CRISPR中的短DNA序列与病毒中的匹配，提示该系统可能是一种适应性免疫途径，用于抵御病毒感染（图2A）。随后，好奇的研究者进一步发现，CRISPR系统利用这一序列阵列转录得到RNA分子，引导Cas蛋白进行剪切破坏病毒的DNA或RNA. 进一步的研究还发现，CRISPR的RNA编程剪切能力能够以前所未有的简便方式改变任意细胞的DNA序列。在过去十年中，全球的科学家迅速接纳了CRISPR方法，广泛运用于动物、植物和人类的基础研究和应用领域。
CRISPR-Cas9蛋白及其搭档RNA的复合物是目前应用最广泛的基因组编辑器（图2B）。CRISPR能够通过RNA导向识别DNA的特定序列，进行剪切并产生DNA断裂，是其用于基因组编辑的关键机制。同时由于真核细胞具有高效修复DNA断裂的能力，因此可以根据需要随意改变DNA序列。Cas蛋白利用RNA-DNA碱基配对来识别DNA，以Cas9为例，同一蛋白可以通过简单替换向导RNA来靶向广泛的DNA序列。在Cas9活性位点中改变剪切行为的目标氨基酸，就能够实现所需的DNA切口（nicking，即剪切单链DNA得到的切口），或通过无催化活性的Cas9实现DNA结合。这样，第一批基因工程CRISPR-Cas系统应运而生，通过转录的抑制或激活实现特定基因的沉默或上调。通过基因工程设计不同的Cas9和酶结合后，便可以实现个体碱基编辑、核染色质改造或基因序列插入。此外，研究者还基于大量生物化学和结构解析的研究结果，探索了其他一些Cas蛋白，这些蛋白能够靶向RNA改造基因组。其中，部分酶还被用于开发成像技术和诊断方法。
图2 基于CRISPR的获得性免疫提供了可编程的基因组编辑工具（A）CRISPR免疫系统靶向微生物DNA或RNA（图中以靶向DNA为例）。免疫过程分为三步：（ⅰ）获取与传染介质匹配的CRISPR间隔区序列；（ⅱ）转录并生成Cas-RNA复合物；（ⅲ）寻找并破坏监视复合物。（B）CRISPR-Cas9是用于RNA导向基因操纵的标准基因组编辑工具。Cas9通过结合前间隔序列邻近基序（PAM序列，是CRISPR-Cas9系统识别和剪切靶向DNA的必需元素之一）寻找基因组中的目标位点，与互补DNA形成R环（RNA-DNA杂交体），生成一个双链DNA（dsDNA）断裂，最终释放DNA以进行修复
综合以上方法，研究者以CRISPR技术为基础开展了一系列临床试验，用于治疗镰状细胞病、β-地中海贫血、退行性疾病转甲状腺素蛋白（TTR）淀粉样变性和先天性眼病，同时也尝试罕见病（如儿童早老症、重症联合免疫缺陷病及家族性高胆固醇血症）和常见病（如癌症和HIV感染）的新疗法。此外，CRISPR技术还推动农业技术进步，包括生产光滑皮毛表型的基因编辑牛和营养价值更高的番茄。CRISPR为分子和细胞生物学领域注入动力，为数以千计的研究论文提供基础，为许多医学、农业及合成生物学公司提供工具。即便如此，目前的CRISPR技术仅仅是初露锋芒。本文将继续在下一章节讨论一些如今已经常规应用的基因编辑技术，以及一些由于技术限制而具有挑战性的方法。这些基因编辑的技术挑战将通过日益完善的基因操纵工具箱得到解决，从而为这些领域的新发现和基因工程进步提供机会。
CRISPR诱导的基因敲除
图3 基因组编辑工具箱的第一层：卓有成效（A）真核细胞的CRISPR诱导基因敲除过程：Cas9RNP产生DNADSB后，通常通过内源性接合修复途径修复。（B）随着CRISPR-Cas9编辑技术的进步，实现通过编辑单细胞胚胎生成基因改造小鼠，制造KO小鼠和其他动物模型的速度大大提升。（C）CRISPR筛选用于基因功能筛选。CRISPR-Cas9编辑器在模型中引入基因扰动，筛选实验进行特定扰动并读取生物信息，评估扰动的效果。（D）CRISPR-Cas9为植物的多重编辑提供技术平台。Cas9可利用多个gRNA同步编辑基因组中的多个目标基因。（E）CRISPR碱基编辑器通常是nCas9或dCas9与脱氨基酶的融合蛋白，在不产生DSB的情况改造特定位点
过去十年中，CRISPR诱导的基因敲除技术在世人的震惊下横空出世，彻底改变了基础和转化研究，并在农业和医学中展现出巨大潜力。经典的真核细胞CRISPR诱导敲除方法采用CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP），它由Cas9核酸酶和基因工程设计的单链向导RNA（sgRNA）组成。sgRNA将Cas9引导至目标位点，从而引起DNA双链断裂（DSB）。该断裂继而被内源性修复途径修复，包括非同源性末端接合（NHEJ）和微同源介导的末端接合（MMEJ）途径，以及利用修复模板进行的同源介导的更精细双链DNA修复（HDR）途径（图3A）。由于CRISPR-Cas9的靶向特异性和效力方面表现出色，这种基因敲除技术已常规应用于研究领域，为敲除基因进行功能研究提供了简便流程。
CRISPR-Cas9成功实现了快速制造基因敲除（KO）小鼠和其他动物模型（图3B）。传统的基因靶向技术首先进行效率不高的胚胎干（ES）细胞同源重组，接着对经改造的ES细胞进行耗时费力的筛选得到所需的变化序列，最后注射进野生型（WT）胚胎。CRISPR-Cas9则在单细胞阶段胚胎产生DSB，避免筛选目标ES细胞的阶段，大大简化了基因编辑动物的生产流程。利用CRISPR-Cas9技术，制造基因改造小鼠所需的时间从一年缩减至四周。由此，如今的科学研究中往往会常规制造KO和转基因小鼠。此外，由于大多数哺乳动物缺乏建立成熟的ES细胞系，CRISPR-Cas9编辑技术也能够帮助开发新物种的基因编辑动物模型。随着CRISPR-Cas9组件引入受精卵策略的不断进步，研究者能够更高效地开发KO和转基因动物模型，例如通过受精卵CRISPR RNP电穿孔技术（CRISPR-EZ）、CRISPR RNP电穿孔和腺相关病毒供体感染技术（CRISPR-READI），以及通过输卵管递送核酸的优化基因组编辑技术（i-GONAD）等新策略。除了编辑生殖细胞系外，CRISPR-Cas9也能够编辑体细胞，特别适用于全身基因敲除会导致胚胎死亡，或需要对癌症进展进行精确造模并模拟真实治疗方法的研究。活体递送策略的进步扩充了体细胞动物模型的种类。CRISPR基因组编辑方法能够制造许多疾病的动物模型，包括酪氨酸血症、杜氏肌营养不良症、癌症、骨质疏松症、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、阿尔茨海默病和艾滋病病毒1型艾滋病等。高效的动物造模极大地推进了遗传病研究，研究者能够深入探究特定遗传变异与疾病之间的因果关联，从而开发并测试新的疗法。
CRISPR筛选
由于CRISPR诱导基因敲除相当便利，研究者已经成功利用这项技术进行遗传筛选（即并行对多个基因开展系统性的遗传改造）。这种CRISPR筛选有利于理解遗传相互作用和解析生物学通路，从而推动发现治疗靶点并开发药物。CRISPR筛选的能力正不断增强，特别是在与单细胞多组学技术进步的结合后。遗传筛选通常涉及一个或多个基因扰动、一个模式系统（如基因工程人类细胞），以及一种筛选实验或生物信息读取手段以够评估基因扰动的效果（图3C）。由于CRISPR编辑效率高、灵活性好，是引入基因扰动的强大策略，可用于精细研究敲除单个基因对特定细胞的影响，以及在合并筛选中对大量基因扰动进行高通量测定。由于目前设计并克隆向导RNA（gRNA）相对容易，研究者得以成功构建基因组水平的gRNA文库，从而能够扰乱人类基因组中的所有基因。CRISPR技术进步也拓展了CRISPR筛选方案的种类，实现各种功能。除了CRISPR KO的筛选方法，热门方法还包括CRISPR干扰（CRISPRi）和CRISPR激活（CRISPRa）筛选，利用可逆基因表达控制手段进行筛选。饱和式基因组编辑则利用Cas9介导HDR，能够生成任意可能的单核苷酸多态性（SNP）用于功能筛选。近来，研究者尝试利用CRISPR碱基编辑和先导编辑替代Cas9介导HDR进行基因筛选。碱基编辑相对Cas9介导HDR能够高效引入点突变，减少得失位形成，或将成为功能多样性筛选的更优策略。先导编辑则插入和删除包含点突变的小片段，在残基中实现饱和突变。先导编辑这项新技术还需要进一步测试，目前并不明确其在靶向目标和窗宽的灵活性上能否达到HDR的水平。
CRISPR技术能够成功编辑多种细胞和有机体，这意味着遗传筛选研究中能够灵活选择最优的模型系统。除了初级细胞生物外，研究者还在不断开发CRISPR筛选技术，用于更复杂模型系统中，如类器官、动物和植物。CRISPR筛选已成为探究癌症中基因功能的常规方法，已经成功鉴定一系列癌症的驱动和调节基因。
将CRISPR组件引入生物模型后，可用各类技术进行筛选实验和生物信息读取。常规筛选策略包括基于生存或生殖能力检测、利用细胞表面蛋白（如PD1、PDL1和MHC）作为标记的荧光激活细胞分选或微流控辅助分选，以及在体表型分析，如肿瘤生长或对免疫疗法敏感或抵抗。CRISPR筛选中用于读取生物信息的新技术，包括Procode、Perturb-ATAC、Perturb-seq和ECCITE-seq，能够同步提供蛋白组学、表观遗传学和/或转录组学分析等大量有价值的信息。CRISPR筛选技术将会继续加速发展，提高实验和生物信息读取的敏感性。目前的研究成果还只是CRISPR筛选和单细胞多组学与大数据采集和分析建设系统的初步结合。未来随着进一步的发现和基因工程技术进步，直系同源Cas9酶或Cas12a等其他RNA导向核酸酶的功能增强，同样将极大增加组合或多重CRISPR筛选的潜能，从而揭示新的和复杂的遗传交互作用。
多重基因编辑在植物和其他生物中的应用
多重基因编辑能够同步靶向基因组中多个特定DNA位点，代表CRISPR诱导基因敲除技术成功拓展并适应于其他学科领域，尤其是植物科学（图3D）。在过去十年间，CRISPR-Cas9成为植物基因编辑的热门工具。传统作物性状的基因工程方法主要包括随机诱变（如利用辐射）或利用农杆菌进行转基因，然后通过耗时费力的杂交和筛选鉴定出具有目标新性状的植物。这些方法耗时较长，控制较难，同时存在监管问题。而CRISPR诱导基因改造则靶向明确、效率很高，且在性状的基因工程位点中产生较少的得失位（基因插入和/或删除）或点突变。CRISPR-Cas9可同步进行多位点编辑，靶向多个不同基因，这对于编辑携带多份目标基因拷贝的作物类（如六倍体小麦）以及涉及多个不同靶向基因的作物驯化而言尤其有用。CRISPR-Cas9多重编辑的一个优点在于能够分离核酸酶和gRNA，由此一个Cas蛋白能够利用多个gRNA编辑不同目标。gRNA能够作为多个个体基因表达的工具盒插入，通过各自的启动子被转录，也可作为转录后的单个多顺反子的工具盒插入。在过去数年中，CRISPR多重基因组编辑技术已经在植物学科领域大获成功，用于制造新作物基因表型和在单一代作物中制造农业上有用的表型。多重CRISPR-Cas9编辑大放异彩的领域之一便是用于作物驯化和增强。其中包括利用多重编辑技术干扰驯化基因、引入耐除草剂基因，以及增加作物产量和提高品质。
多重CRISPR-Cas9编辑在植物之外的细胞种类和有机体中也得到了应用。一个值得关注的例子是利用多重编辑技术制造猪内源性逆转录病毒灭活猪，以此解决猪器官移植给人类的安全性问题。此外，多重编辑有潜能用于基因工程制造癌症的细胞疗法产品，以及研究复杂的多基因病。但在哺乳动物细胞中进行CRISPR-Cas9编辑还存在一些问题，尤其是多重编辑中同步进行DNA剪切可能会诱发转录因子p53介导的DNA损伤反应机制，导致细胞衰老或凋亡。CRISPR精准编辑技术可能会解决这一问题并拓展多重编辑的应用领域，这些避免引入DSB的新技术包括碱基编辑和先导编辑，已经在多重编辑中得到应用。
利用碱基编辑实现位点特异的基因改造
传统的CRISPR诱导基因敲除技术会产生双链DNA剪切，而碱基编辑技术利用Cas效应器与酶的融合蛋白改变DNA剪辑的化学本质，能够在不产生DSB的情况下精确产生位点特异的精确点突变，因此无须修复模板，产生更少的编辑副产物（图3E）。CRISPR
碱基编辑器通常由Cas9切口酶（nCas9，或其他无催化活性或“死”Cas蛋白，如dCas9、dCas12a或dCas13b）和催化核酸碱基脱氨基反应的酶融合而成，其中nCas9是一种Cas9变体，能够产生单链而非双链断裂。sgRNA作为向导将nCas-脱氨基酶融合物带至基因组上的目标区域，三者的复合物将单链DNA（ssDNA）区域暴露给脱氨基酶并产生化学修饰。产物中的碱基错配则由细胞修复机制解决。过去数年中，DNA和RNA剪辑编辑器工具箱不断进步，能够实现C>T（C替换为T，下同）、A>G、C>G、A>I和C>U的碱基替换，但还有进一步完善的空间，尤其是C>G的编辑。位点特异的基因改造让研究者能够进一步研究基因变异的结果，并能够通过校正点突变治疗遗传病，这是因为点突变是导致人类致病性遗传变异的主要原因。碱基编辑还可以在分裂和非分裂细胞中进行基因改造，这优于仅可用于分裂细胞的HDR. 碱基编辑在一系列小鼠模型中展现出校正功能缺失突变的可喜结果，有团队报告通过在体碱基编辑治疗小鼠早老症。碱基编辑技术不断发展，减少引入DSB，这代表着精确编辑的一大进步。在未来十年，如何优化这些工具的准确性和精确性以用于治疗人类遗传病将会是领域中的一大挑战。一个利用碱基编辑治疗家族性高胆固醇血症的早期临床试验已经开始，另一利用该技术治疗镰状细胞病的临床试验也预定于2023年开始。
编辑准确性和精确性
图4 基因编辑工具箱的第二层：挑战和新工具（A）编辑的准确性和精确性。编辑准确性指靶向目标位点的特异程度，Cas9RNP可能脱靶结合而使准确性下降。编辑精确性指产生正确的目标编辑，而不产生非目标的编辑结果，不希望产生的得失位和旁观者编辑会导致精确性下降。（B）利用目前的碱基编辑器校正SNP的不精确性。校正精度的定义是疾病相关单核苷酸位点变异（SNV）文库中可由腺嘌呤碱基编辑器（ABE）校正的可编辑读段，能够实现精确的单核苷酸校正。（C）由HDR介导的CRISPR-Cas9编辑（左）和先导编辑（右）实现基因序列插入。（D）基因编辑递送过程中存在的问题，一些生物学机制会阻止基因编辑物到达靶向位点
当我们踏入CRISPR基因组编辑的下一个十年，需要继续用创新方法解决包括编辑准确性（即特异靶向目标位点的能力）和精确性（即产生目标编辑结果的能力）在内的数个挑战（图4A）。为了减少CRISPR-Cas核酸酶因意外结合和剪切而产生脱靶效应，研究者应用各种合理设计和筛选开发了高保真的Cas变体（如SpCas9-HF1、evoCas9、HiFiCas9和Cas9_R63A/Q768A变体），并采用了优化方法（如E-Crisp、CasOFFinder和sgDesigner）。其结果喜人：目前临床上应用的CRISPR Therapeutics/Vertex和Intellia sgRNAs使用美国食品药品管理局（FDA）级别的实验方法，都不存在可测量的脱靶位点。但除了Cas9之外，脱靶编辑的不准确性还存在与效应区域相关的因素，碱基编辑结果分析显示这些原因包括脱氨基酶、逆转录酶和转录调节因子。如今研究者在解决这一问题方面取得了一定的进步，他们利用高保真Cas变体以及合理的脱氨基酶区域基因工程设计来减少非Cas辅助的核酸结合，而早期的碱基编辑临床试验在这方面带给研究者一定信心。同时，发明新的Cas编辑器递送至目标位点的方法，以及优化现有方法也能够减少脱靶效应。编辑精确性则是更大的挑战。经典的真核细胞CRISPR-Cas9编辑中，科学家无法完全掌控引入DSB后的编辑结果。近来，新开发的机器学习工具能够辅助预测修复DSB后的结果，但这一技术还未实现在体应用。DSB后的人类细胞中的默认修复途径（NHEJ）会和效率相对低的HDR途径竞争，导致目标位点产生一系列得失位。尽管这对于CRISPR诱导敲除的许多应用（包括临床应用）而言还可以接受，但许多临床应用需要更高的精确性，无法承受得失位带来的风险。提升编辑的精确性需要更好地理解DNA修复进程，并结合创新方法和基因工程设计。一种方法是促进HDR的效率，和/或抑制NHEJ. 研究者开发了一系列策略，包括化学抑制NHEJ途径的关键酶、利用单链寡脱氧核苷酸模板（在人类细胞单核苷酸替换中能够将HDR效率提升至60%）、控制细胞周期阶段来促进HDR修复，以及利用位点特异的Cas9-寡核苷酸接合物向目标位点招募供体DNA模板。即使运用这些策略，也存在和DSB形成相关的大型删除和染色体重排风险，这会导致基因组不稳定。碱基编辑和先导编辑技术是避免DSB形成的精确编辑方法，二者相对经典Cas9介导编辑能够减少得失位的形成。但在一些案例中编辑位点仍然会出现预期外的DSB，并产生得失位。研究显示通过将碱基编辑器和Gam（一种噬菌体Mu蛋白，能够和DSB结合）融合，能够减少碱基编辑时的得失位形成。对于碱基编辑，旁观者编辑也会影响编辑的精确性，这是指编辑窗宽内或附近的目标碱基外的可编辑碱基（旁观者）产生了预期外的变换。碱基编辑器的校正精度会因为编辑窗内存在一个或更多目标碱基而大幅下降，这限制了其用作治疗方法的潜力（图4B）。最近的一项研究显示，大约一半的致病单核苷酸变异（SNV）通过腺嘌呤剪辑编辑器校正，能够达到≥50%的校正精度。但是当部分SNV在编辑窗中包含超过1个目标碱基时，其≥50%的校正精度就会下降到26%。然而目前的剪辑编辑器常常发生旁观者编辑。最近一项研究纳入了21个不同的碱基编辑系统，发现大约有一半的可靶向致病点突变在这些编辑系统的编辑窗内存在旁观者。缩小编辑窗宽能够增加精确性，但PAM约束会限制可靶向的基因位点。许多策略使用结构导向的变异发生、定向进化和计算机辅助设计，以增加CRISPR-Cas9的可靶向范围，减少碱基编辑器的旁观者效应。如果希望将碱基编辑作为有效策略广泛应用，就需要基于目前的策略进一步进行基因工程设计，在不妥协效率和靶向特异性的条件下开发具有更小编辑窗和更广PAM适用性的碱基编辑器。
基因序列插入
近年来随着技术进步，CRISPR工具箱的功能愈加丰富，实现了在基因组中插入可精确编辑的基因序列，下一个十年的目标将是在基因组编辑应用中优化并高效利用这些技术。经典的Cas9编辑通过HDR从共递送供体模板中获取基因原料，向目标位点中引入转基因（图4C）。目前这一方法广泛运用于基因组工程中的许多领域。最近值得关注的研究是通过这一方法将荧光标记整合进超过1 000种人类蛋白质中，研究它们的定位和交互作用。HDR介导的CRISPR-Cas9编辑在治疗方法的临床前和临床测试（尤其是α1-抗胰蛋白酶缺乏症和肿瘤免疫疗法）中取得了令人鼓舞的结果。但HDR介导的CRISPR-Cas9也有其局限性，例如它只能用于分裂细胞中，供体模板递送也存在困难，并且在引入DSB后还存在精确性问题。虽然碱基编辑技术能够处理特定单核苷酸变异，但许多人类致病性基因变异需要通过插入小的基因序列以修复得失位，因此需要比HDR介导CRISPR-Cas9更精确的方法。
先导编辑是另一种不引入DSB的情况下插入和删除DNA序列的方法，但其技术方法还需要进一步优化。先导编辑器的组件是nCas9和逆转录酶（RT）的融合物，以及先导编辑向导RNA（pegRNA，用于指示nCas9到达目标位点，并用作指导RT进行编辑的模板）。不同于HDR方法，先导编辑能够在分裂和非分裂细胞中引入基因改造，这对于校正静止期细胞（如神经元或造血干细胞）的变异而言很有用。当编辑窗内存在多个目标碱基，以及PAM序列不紧邻目标编辑位点时，先导编辑相比碱基编辑也具有一定优势。目前先导编辑已经应用于多种细胞类型、类器官、小鼠胚胎和植物，是一种准确而相对精确的编辑工具，但较低的编辑效率限制了其应用。在类器官和小鼠中应用先导编辑的研究中并没有检测到脱靶编辑。研究报告的预期外得失位形成很少，先导编辑中正确编辑与得失位形成的比例相对HDR要高约30倍。遗憾的是，很多应用中先导编辑表现出较低的效率。在一项与修复肠道囊性纤维化（CF）类器官变异有关的研究中，先导编辑的效率相对HDR要低30倍。虽然研究者因此开发了许多高效先导编辑方法，但却形成了更高比例的得失位。目前碱基编辑器在编辑效率和精确性上仍然优于先导编辑。未来十年中先导编辑的目标是在不妥协编辑产物纯净性的条件下提高效率，如此先导编辑可能成为功能最丰富的精确编辑方法。近期研究发现将Cas9和RT在物理上分开并不会影响细胞中的先导编辑水平，提示RT能够在不与Cas9融合的情况下与编辑位点结合，这是否意味着RT会在其他RNA-DNA杂交位点产生预期外的结合？还需要进一步研究，才能得到结论。优化先导编辑工具需要基因工程设计，以及优化pegRNA等组件。
要实现大型基因插入，CRISPR基因组工程的新兴方法是RNA导向的DNA转座技术。CRISPR相关转座子（CAST）能够实现RNA导向下精确整合进多达10kb的大型DNA序列。目前这一技术仅应用于一些原核细胞，暂无应用于哺乳动物细胞的报道。该新兴领域还处在早期阶段，其工作机制还需要进一步阐明，也少有计算机预测CAST系统得到表征。在CAST应用于基因组工程前还需要进一步的科学研究、测试和基因工程设计。
重组酶功能丰富，能够实现基因的插入、删除、倒位和置换，将重组酶与Cas蛋白相结合成了工具开发的新方向，或将进一步丰富CRISPR工具箱的功能。近期，这种新方向带来了两种新方法，能够通过基因编程在人类细胞中整合进大型DNA序列。其中一种方法利用位点特定靶向元件的可编程扩增物（PASTE），通过Cas9、逆转录酶和丝氨酸整合酶三者的基因工程融合蛋白实现多重插入大型DNA序列，包含不同内源基因的荧光标记。另一种方法利用双先导编辑（twinPE），包括一个先导编辑器和两个先导编辑向导RNA，在与位点特异丝氨酸重组酶结合时能够实现大型基因的插入和倒位。研究利用这一方法校正人类细胞中和亨特综合征相关的大型倒位序列，其效率可达约9%。值得注意的是这些研究并没有报告可检测的脱靶插入。可编程基因插入的方法需要进一步表征和优化，以增加编辑效率用于潜在的治疗方法。可编程基因插入对基因组工程的潜在影响将会继续推动发现和创新，在寻找新方法的同时优化现有技术。
体内外的编辑器递送
近来，CRISPR编辑器的技术进展颇多，但编辑器的递送方法成了有机体中基因组编辑技术的瓶颈，需要创新方法和基因工程设计以提高递送效率、靶向特异性和安全性。递送技术的进步在开发基于CRISPR的治疗方法中有重要意义。肝脏是很好的例子，向肝脏递送CRISPR编辑器的效率高，因此CRISPR技术在临床上可用性较高。但是对于一些难以递送的器官，CRISPR治疗方法的可用性就会被低递送效率影响，从而需要进一步开发递送策略。目前用于人类的潜在CRISPR疗法在递送策略上有两种：体外方法，也即细胞在患者体外进行分离和改造后引入体内；以及体内方法，也即直接递送CRISPR组件对患者细胞进行编辑。体外方法常用于编辑造血干细胞、祖细胞以及白细胞，在细胞类型上具有较高的特异性，编辑的质量控制也较为严格，但编辑的细胞必须能够在体外培养中存活和扩增（达到重新移植的最低要求），并在体内恢复细胞功能，因此限制了细胞种类。体内方法相对于体外编辑扩展了CRISPR编辑的细胞种类，让CRISPR可以治疗更多种遗传病。利用体内递送在人体中获得一定成功的两个案例是：一例是治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性，这是第一例系统性的体内CRISPR递送，利用靶向脂质纳米微粒（LNP）将CRISPR组件递送至肝脏；另一例则是治疗先天性黑蒙症10型，通过直接注射腺相关病毒载体将RNA向导酶运送至眼球中。
成本、管控和可得性
随着CRISPR技术逐渐展现治疗潜力，需要进一步考虑可支付性、监督管理和可得性等重要因素。CRISPR治疗方法发展和普及的主要挑战是成本问题。这种疗法的制造成本会包括生产CRISPR编辑器和递送介质的花费，实现大规模生产面临诸多困难。举例来说，基于病毒的递送系统是开发CRISPR疗法中的热门策略，但生产病毒介质需要昂贵的培养系统和能够生产足量病毒的设施。因此降低成本的重要方法是继续优化开发过程，并建立相关设施增加制造病毒载体产量。此外，治疗方法过程本身成本也较高，尤其是体外方法在培养基中扩增细胞耗时费力，同时对于自体造血干细胞骨髓移植的患者还需要在治疗前接受化疗。
生产厂商也要负担监管成本，进行额外的表征和严格的安全与质量控制，这对于研发型或学术型生产厂商而言具有挑战性。随着许多基于CRISPR的治疗方法逐渐进入后期临床试验，生产厂商需要建立设施并负担成本，以提供符合实际要求的产品。厂商需要自负成本以得到FDA批准，这在逐利的情景中可能会导致厂商放弃开发治疗方法，近期就出现在腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷症（ADA-SCID）的基因疗法开发中，尽管其展现出有前景的长期结果。即使一种治疗方法通过了所有的临床试验阶段并得到了FDA的批准，多数患者也承受不起厂商为收回开发成本而设定的零售价格，这需要卫生保健系统进行一定的支持。尽管开发新疗法的成本不可避免，但用CRISPR治疗技术造福人类的动力，将会激励创新，开发出高效率、低成本，同时符合监管标准的生产策略。
这些成功案例展现出体内基因组编辑技术的无限潜力，但总体而言，有效体内递送CRISPR编辑器仍然存在许多生物学困难。对于系统性递送技术而言，递送介质需要保护“货物”在从血管外渗的过程中不被降解，避免调理作用和吞噬作用，继而高效穿过组织间隙，最终通过内吞作用高效释放货物（图4D）。CRISPR货物释放后需要定位细胞核并靶向染色体的目标位点。从第一步血管内注射到最终实际靶向位点的编辑效果的每一步，都有一系列困难需要基因工程设计和创新加以攻克。其中一个问题是如何控制递送介质的尺寸（通常由货物的尺寸限制），这对于绕过血管内皮和血管间的组织间隙并靶向细胞是一个挑战。研究者为此致力设计并开发更小的CRISPR编辑器，以提升递送效率。另一个问题是防止靶外细胞摄取编辑器并进行编辑，解决方法可以在CRISPR RNP上结合一个靶向分子，如抗体单链可变片段或糖蛋白。还可以利用基因工程设计或进化手段使递送介质靶向特定细胞。一种系统性递送的策略是对目标组织进行注射，能够避免对其他组织或器官进行编辑。但直接注射会让基因组编辑的范围限定在局部空间的相对少量的细胞中，而且还需要目标器官具备进行这种直接注射的条件。
在各类方法中，“货物”共有三种形式：质粒DNA（>6 400kDa，运送10kb质粒DNA）编码CRISPR-Cas9和gRNA（二者一同或分开均可）、Cas9 mRNA（1 400kDa）和gRNA（34kDa），或Cas9-gRNA RNP（194kDa）。相较于RNA或蛋白质，DNA货物较为稳定，但编辑起始速度较慢，且在编辑过程中控制功能RNP浓度的能力较差。在一些案例中DNA货物能够延长Cas9的表达，增加了脱靶效应和免疫原性反应的风险。三者中RNP递送的编辑起始速度最快，脱靶效应最小，但递送RNP的方法最为有限。
目前用于哺乳动物系统CRISPR基因编辑的递送手段很多，但每种方法都有需要解决的问题和应用的限制。这些方法主要分为物理递送、基于病毒的递送和基于合成材料的递送。常用的物理递送手段包括显微注射和电穿孔，适用于上述三种货物形式的CRISPR编辑器，可以控制数量且递送效率高，但这种方法只能用于体外递送。基于病毒的递送方法包括腺相关病毒（AAV）、腺病毒（AdV）和慢病毒，能够递送质粒DNA形式的CRISPR货物，通过人为控制病毒千万年间进化获得的能力高效地完成递送。其中AAV作为CRISPR疗法在体内临床使用中最具前景，目前值得关注的是进行中的先天性黑蒙症10型临床试验、一项即将开始的HIV临床试验，以及早老症临床前工作都取得了进展。然而，AAV的主要局限在于其运载能力较低。相比之下，AdV和慢病毒具有更大的运载能力，也被用于CRISPR-Cas9的递送系统，但面临包括免疫原性问题在内的许多其他挑战。基于病毒的递送系统的另一个问题是其高昂的成本，以及劳动密集型的生产方式，AAV和AdV尤其显著，这是实现大规模生产用于治疗患者的主要挑战。基于合成材料的递送相对于病毒递送在安全性、可控性和灵活性方面具有优势。例如，LNP、阳离子聚合物和肽，以及金纳米微粒等材料能够进行量身定制，可运输三种形式的货物（DNA、mRNA和RNP），且免疫适应性好。值得注意的是LNP如上文所述是首个人类系统性体内CRISPR递送中使用的递送策略，成功治疗了转甲状腺素蛋白淀粉样变性。总的来说，基于合成材料的递送方法相较病毒递送方法效率不高，这限制了其在体内递送至可及性不佳器官的能力。尽管通过优化能够进一步提高递送效果，但最高效率会被合成材料臃肿的体积以及阳离子的特性（影响其进入组织间隙的能力）而限制。近期，细胞外囊泡和病毒样颗粒（VLP，病毒衣壳和/或结构蛋白的类似物，能够转染细胞但不具有病毒的遗传物质）成为递送技术中具有前景的方法，它结合了基于病毒和合成材料递送方法的优点，在具有病毒递送的高递送效率的同时，不用担心其随机转基因整合造成安全问题或编辑器表达时间过长。领域中令人激动的技术进步是利用不同的衣壳糖蛋白靶向特定细胞种类，这利用了VLP的细胞趋向性，近期在体内外递送和编辑中都有成功案例。人类CRISPR疗法的未来将很大程度上取决于以下几点：不断进步的递送策略、创新性的递送方式、发现并设计更加紧凑的CRISPR编辑器。
在哺乳动物系统外，植物中CRISPR试剂的递送技术也有进步。植物的细胞壁的分子大小排除限（SEL，可经扩散作用通过胞间连丝的最大分子直径）约5至20纳米，这为货物运送带来了挑战。目前的两种主要方法分别是利用农杆菌递送质粒DNA（将转移的DNA整合进植物基因组中），以及基因枪法（物理上将细胞壁打开缺口，引入货物）。这些方法的主要缺陷在于CRISPR工具盒会随机插入植物基因组。为了实现无转基因的育种，研究者设计了一些RNP递送的新方法，包括利用聚乙二醇介导细胞转染、基因枪法、电穿孔或脂质转染。这些方法具有一定前景，随着递送效率的提高，以及原生质编辑使植物再生能力提升，RNP在植物中会有更广泛的应用。
现在和将来的应用
可编程基因组编辑技术的问世为细胞和基因疗法治疗甚至治愈癌症奠定了基础。CRISPR疗法的应用不胜枚举，其中镰状细胞病（SCD）的疗法称得上是价值和风险共存的极佳案例。目前FDA批准了至少8个基于CRISPR的SCD疗法临床试验，且有更多针对血液系统疾病的试验正在进行中或是即将开始，预计FDA将在2023年正式批准首个疗法。然而，广泛利用CRISPR治愈SCD仍面临诸多困难。为了将基因组编辑技术作为一种标准疗法，需要解决为每一个患者量身定制基因编辑细胞的难题、骨髓移植相关的安排协调问题，以及昂贵的价格问题——每位患者可高达2 000 000美元。但如果一种新的基因组编辑器递送形式问世，不再需要体外细胞编辑和骨髓移植，CRISPR疗法将发生天翻地覆的变化，进入全新的时代，基因疗法技术会得到更加广泛的应用。
CRISPR技术在临床应用之外，正对农业和畜牧业产生深远影响。CRISPR编辑食物正准备进入市场，包括CRISPR技术改良的营养丰富的番茄，以及两种CRISPR编辑的鱼类（生长速度快的红鳍东方鲀和可编辑区域更广的红鲷）在日本获批上市。这些农业应用中，CRISPR实现了小片段基因改变的精确“转移”，让目标性状能够从一个物种转移至另一个——其他任何方法都无法实现。除了小片段基因扰动外，CRISPR也具有产生性的基因变异和复杂基因编辑的潜力，这在技术出现前从未在自然界中观察到。一个关键的案例是近期利用多重编辑在小麦中同时敲除和激活不同的基因，引入抗病性的同时恢复生长能力和产量。这些只是各式基因组编辑技术的开始，这项技术在未来将继续对我们的生活产生影响。
图5 技术发展的方向：十年后及更远的未来 CRISPR基因组编辑技术未来将会与机器学习、活细胞成像和测序等技术进步相互交织。在不远的将来，FDA会批准第一个基于CRISPR的疗法，越来越多的CRISPR治疗方法将会进入临床试验后期，同时有更多新的临床试验测试优化体内递送方法。我们希望更多CRISPR编辑作物批准上市，更多CRISPR技术应用于动植物领域，对多基因性状进行基因工程设计。在更远的未来，我们或许会看到基于CRISPR的治疗方法被广泛应用，甚至利用基因组编辑技术实现猪器官安全地移植进入人体，以及该技术成为一种预防性治疗的手段。在农业领域，CRISPR或许将常规应用于生产抗病性、高产量作物以增加全球食物供应和安全性
CRISPR-Cas9作为细菌免疫系统的一部分，利用RNA导向机制识别并剪切DNA序列。这一基础的生物化学过程成了基因组编辑技术的基础，拓宽了基础和应用生物学研究的边界，从发育生物学和植物遗传学，到镰状细胞病的医疗方法和畜牧业。新的基于CRISPR的酶以及和CRISPR相关的酶将不断出现，帮助我们更好地理解微生物系统的生物学本质，并利用它们在其他细胞和有机体中进行基因组编辑。CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a是最为广泛应用的基因组编辑酶，成为全球科研实验室的工具。基因组编辑技术赋能的基础研究证实了CRISPR技术的跨领域本质，也展现其作为可用工具出现的良好时机。其广泛应用反过来推动CRISPR工具箱进步，用于特定核苷酸的精准编辑，以及整合产生新的遗传信息。在未来的十年中，基因组编辑研究和应用将会继续加速，并与机器学习、活细胞成像和更快、更便宜的测序技术结合（图5）。上一个十年的研究重点在于建立CRISPR平台，那么这些平台在下一个十年种将会展现出真实世界中的影响力。在诊所中我们将看到更多各式各样的临床试验，为开发下一代基因和细胞疗法提供数据基础。随着临床应用的扩展，CRISPR或将成为一种保护健康的工具。举例来说，当基因编辑在治疗疾病中足够安全和有效之后，或许能够用于预防神经退行性疾病和心血管疾病。这一方向需要深入理解多基因病的遗传学本质，并开发靶向脑和心的递送方法——二者都绝非易事。这些领域的潜在利益将会激励研究者取得目前无法想象的成果。在农业中，CRISPR筛选将继续帮助洞见基因工程中动植物的多基因性状。利用CRISPR开发的产品——无论是用于移植的猪器官、抗干旱的高产稻米，或是利用CRISPR编辑技术进行精细的微生物组调节以保持健康——都将成为常规。CRISPR同时也证实了好奇心驱动的研究、创新和技术进步之间的密切关系。当我们继续探究自然世界，将会发现更多的不可思议，并利用它们在真实世界中造福人类和我们的星球。
资料来源 Science
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本文作者乔伊·王（Joy Wang）和詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）来自美国加州大学伯克利分校化学系、加州大学伯克利分校创新基因组学研究所。