早在1898年，J. H. van't Hoff提出通过逆转质量作用，酶促肽合成应该是可能的，1938年，贝格曼（Bergman）和弗伦克尔康拉特（Fraenkel Conrat）首次用蛋白酶催化合成了所限定的肽。酶介导肽合成法与常规的方法相比有几项改进，如没有消旋作用、底物的最低程度保护、没有副反应。一旦达到最适条件，这种合成系统应该容易地对肽进行大规模生产。
只有利用合适的方法如有机辅助溶剂、温度或不溶性产物，除去不利的化学平衡，那种热力学控制的肽合成过程才能顺利进行，另一种方法为非平衡的合成法，即所谓的动力学控制合成法。用这种方法，形成非常迅速而破坏非常之慢的产物将会不断增加。其中蛋白酶催化的反应可用下式表示：
共价的中间物酰基酶可经氨解或水解脱去酰基。如果氨解反应的平衡常数K3高于水解常数K3，那么氨解产物R1-CO-NH-R3会暂时超过它的平衡浓度。这两种脱酰基反应之间的差别可用反应的选择性来表示。选择性而不是酶活性决定了肽键的形成，这种方法能在很短时间内合成产率较高的肽。
对于一个给定的酶和一个给定的呔顺序，运用酶促肽合成法的一个根本问题是必须使每一合成步骤达到最佳状态。我们进行这项工作的目的是为了确定影水解反应之间选择性的主要因素#选择性的高低用所响氨解与形成的二肽与转化的底物酯之比来说明，当底物酯全部转化为二肽时，选择性为100%。
一、酶
好几种酶能催化合成NH3 · 苯丙氨酰 · 丝氨酰 · COOH，因此选择该二肽PheSer作为模型。莫里哈（Morihara）和奥卡（Oka）曾成功地用胰凝乳蛋白酶催化合成了此二肽，产率为35%。根据选择性曲线（略）和Km值判断，枯草杆菌蛋白酶不是最好的催化剂，羧肽酶的催化效率取决于亲核试剂。羧肽酶对游离丝氨酸的特异性不很高，但与枯草杆菌蛋白酶以丝酰胺为亲核试剂时相类似；该酶对丝氨酰乙酯的特异性很低，这是因为酶的过度反应，主要在新激活的C末端发生了低聚化。以丝酰胺作为亲核试剂，羧肽酶的特异性与胰凝乳蛋白酶的特异性相似。合成N末端带有苯丙氨酸衍生物的肽序列，胰凝乳蛋白酶是最好的催化剂。因该酶对芳香族氨基酸有明显特异性。丝酰胺的低Km值是由于酶活性部位的天冬氨酸与亲核试剂的酰胺之间的相互作用，从而使丝酰胺能较好地与该酶的S2结合部位相结合，
二、pH
根据动力学控制的肽合成过程可推断，反应溶液的pH值可以在两个阶段影响选择性，即活化的底物与酶的结合和第二个氨基酸衍生物对酰基酶的脱酰基作用。实验证明pH通过影响活化底物与酶的结合来影响选择性。底物的侧链对最适pH有较大影响，而亲核试剂的侧链影响很小。去质子的游离氨基酸能降低最适pH，而C末端保护基团的作用相反，但保护基团的类型，酰胺或脂，与最适pH无关，N末端保护基团没有影响。
三、温度
实验证明反应温度对酶促二肽PheSer合成的选择性影响较弱。对于C末端受保护的亲核试剂，降低反应温度虽然有利于氨解反应进行，同时也降低了酶活性。以游离氨基酸作为亲核试剂，升高反应温度有利于羧肽酶Y催化的二肽合成反应，但在木瓜蛋白酶催化的反应中，发现相反的情况。
四、离子强度
研究离子强度对选择性的影响是在酶促Bz-TyrAla-NH2和Bz-ArgAla-NH2合成反应中进行的。离子强度影响亲核试剂与酶的结合。我们预期，当参与的电荷值不变，提高离子强度，选择性会随之升高。选择丙酰胺作为亲核试剂，因其不含有附加电荷以消除这种效应。
实验发现，增强离子强度却剧烈降低选择性。可能是由于酶结合区域有部分未折迭，从而降低了亲核试剂的结合效率。此效应的强度取决于酶和亲核试剂类型。
五、C末端保护基团
带有非常简单的保护基团如烷脂或酰胺、甚至根本不带保护基团的氨基酸，都可用来作为酶促合成反应的亲核试剂。应用C末端受保护的氨基酸可明显降低亲核试剂的剂量。选择正确的保护基团取决于所用的酶。若酶的特异性较高，像胰凝乳蛋白酶，可使用氨基酸酯。若是羧肽酶Y，其特异性较低，使用氨基酸酯会导致新活化的C端出现低聚化。此时，羧基端不保护或使用酰胺保护基团就能改善之。
六、N末端保护基团
在胰凝乳蛋白酶催化的二肽PheSer合成反应中，我们对三种不同N末端保护基团的作用进行了研究。高度亲水的甲酰基作为保护基团，选择性达到50%需要30倍剂量的亲核试剂。若以疏水、庞大的苯乙酰基作为保护基团，使用同样剂量亲核试剂，选择性能达到100%。弱亲水性、相当小的乙酰基介于甲酰基与苯乙酜基之间。有趣的是，带有乙酰基的亲核试剂在5倍剂量时，选择性已达到90%，然而，其选择性最终达不到100%，不管亲核试剂浓度有多高，乙酰保护基团沪化学和立体本质，说明乙酰基是胰凝乳蛋白酶的理想基团。
乙酰基的主要缺点是除去该基团的程序比较严格，但又必不可少，因为它也能裂解新形成的肽键。能提高疏水性氨基酸如苯丙氨酸或酪氨酸水溶性的甲酰基，能够使酶促合成反应在没有加入有机辅助溶剂的情况下在水中进行，并容易通过降低pH除去。苯乙酰基能被青霉素G酰化酶除去。
有机辅助溶剂DMF用甲醇、乙醇或二甲亚砜DMSO代替，对选择性无明显影响。加入有机溶剂能影响胰凝乳蛋白酶的稳定性。就苯乙酰基而言，在有机 - 水性反应条件下，胰凝乳蛋白酶的半寿期只有8小时，但在纯粹水性反应条件下，该酶对于甲酰基的合成活性在24小时内不受影响。由此可见，加入有机溶剂后，这一长时间的酶稳定性将急剧下降。这会给连续实验带来困难，但合成的产物的稳定性不会降低。
进行这项研究工作是为了鉴定影响酶促合成反应的主要因素。注意以下四个方面，很容易使反应状况达到最佳化：
1）最适pH取决于N末端氨基酸的侧链；
2）离子强度尽可能低；
3）反应温度影响甚微；
4）不同有机溶剂无明显影响。
参与反应的氨基酸的化学衍化有较大影响，小结如下：
1）C末端保护基团的本质取决于所用的酶。酶的特异性较高，使用脂作保护基团，非特异性的蛋白酶要使用氨基酸酰胺或游离氨基酸；
2）同样的反应条件，亲水性N末端小保护基团（甲酰基）被疏水性大基团（如苯乙酰基）交换后，可使选择性从50%上升到100%。关于N末端保护基团对选择性的影响及新酶应用的进一步研究仍在进行之中。
综上所述，反应温度、C末端保护基团类型和不同有机溶剂对选择性的影响很小。酶、过量的亲核试剂、pH、N末端保护基团和溶液的离子强度是影响选择性的主要因素，从而控制二肽的合成。在最佳条件下，胰凝乳蛋白酶催化的二肽PheSer合成反应的选择性能从35%升到100%。
[Biotechnology and Applied Biochemistry，1990年12期]