“光”是生活中不可或缺的资源，人类的发展历程离不开光的使用。早在2 400年前的古希腊，亚里士多德就对光产生了思考，虽然其理论后续被证实是错误的，但还是对光的研究产生了深远的影响。生活中肉眼可见的光是“可见光”，根据波长的不同，光还可以分为无线电波、红外、紫外、X射线和γ射线等。
当可见光照射人体时，会有一部分光反射到我们的眼睛中，所以我们“看到”了他人。但是当X射线照射到人体时，则会穿透人体，通过X光底片记录不同角度穿透人体的程度，就可以复原人体内部的结构。这也是临床中X光电子计算机断层扫描（CT）的原理。
如何利用“光”帮助研究大脑呢？临床中医生通过X光CT对头部进行扫描研究脑的结构与形态，观察其病变情况；光遗传学中，研究光调控神经元的活动；钙成像中，研究者通过观察“闪烁”的神经元记录其活动；荧光成像中，研究者通过向动物大脑注射病毒使神经元发出“荧光”从而观察神经元的形态。诸如此类的方法还有很多， “光”伴随着大脑的研究。我们在这里重点介绍利用基于同步辐射光源的X射线成像对大脑，尤其是神经元结构进行的研究。
从二维到三维神经元成像
神经元是神经系统最基本的结构和功能单位，对大脑的研究离不开对神经元的研究。1873年卡米洛 · 高尔基（Camillo Golgi）发明了高尔基染色法，染色后神经元呈现黑色，首次展现了神经元的结构。接着，卡哈尔（Cajal）对高尔基染色法进行了完善，使其更好地应用于神经科学研究。1906年，高尔基和卡哈尔被共同授予诺贝尔生理学或医学奖。
人类大脑中约有上千亿个神经元，每个神经元又会和成百上千个神经元通过突触连接。想要分析这些神经元如何整合成一个系统并发挥作用，绘制“大脑地图”是重要的突破点。我们知道，绘制道路地图需要标明地点和道路，绘制“大脑地图”也一样。神经元的胞体像是地点，神经元之间的连接像是道路。而绘制地图则离不开对神经元结构的成像。
受限于技术，研究者在早期对神经元的成像更多停留在二维的组织切片中。对神经元的二维成像取得了出色的成果，如1954年利用电子显微镜第一次观察到突触间隙，从而证明卡哈尔的神经系统结构模式理论的正确性。随着技术不断发展，研究者更希望在三维层面上观察神经元，于是三维成像技术开始应用于神经元成像中。从早期的核磁共振成像、CT成像等技术，到近些年来发展的连续切片电子显微镜（SSEM）、显微光学断层扫描系统（MOST）等，在不同尺度上为人们揭开了神经元的神秘面纱。正因为有了这些技术，绘制“大脑地图”成为可能。
绘制人类“大脑地图”的挑战
绘制“大脑地图”容易吗？1986年，研究者通过电子显微镜成像绘制出了线虫的第一张大脑全连线图，线虫拥有302个神经元，这项工作耗费了整整15年的时间。近年来，计算机技术的发展和成像设备的更新换代使得获得图像的速度大幅度提升，但对于绘制人类“大脑地图”还需要进一步提升成像速度。
2021年，哈佛和谷歌的研究团队通过电子显微镜以4 nm的分辨率对人类大脑皮层进行了约5 000片30 nm厚的连续扫描，完成了“百万分之一”人脑神经三维连接图谱。尽管样品仅有针头大小，但其中耗费的时间和精力是难以想象的。该图谱的数据量也达到了惊人的1.4 PB，如果用市面上常见的512 GB储存空间的笔记本电脑来存储数据，要使用近3 000台电脑。所以，按照当前的技术水平，利用电子显微镜来获取完整的人脑神经三维连接图谱是不可能的。
2010年，MOST的问世给研究大脑三维结构带来了巨大的便利，MOST可在数天内完成介观尺度下小鼠大脑的三维成像。2022年，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心和华中科技大学的研究团队合作，对小鼠前额叶皮层的6 357个神经元进行成像，构建了最大的小鼠前额叶单神经元投射图谱。MOST的成像速度和高分辨能力使其广泛地应用于小鼠等模式动物的全脑成像及图谱构建。但是，面对人脑如此大的体量，使用MOST获取数据也需要耗费大量时间。
近些年来从事脑科学的研究者关注到了基于同步辐射光源的X射线成像技术，并应用到神经元的成像中，那基于同步辐射光源的X射线成像技术有何优势呢？
同步辐射光源的X射线
当带电粒子在电磁场中以接近光速的速度沿曲线轨道运动时，会在其运动的切线方向发出电磁辐射。由于它最初在同步加速器上被发现，故被称为“同步辐射”。从同步辐射装置问世至今已出现了四代装置。第一代是依托于高能物理研究的加速器；第二代专门为同步辐射应用设计；第三代拥有更高的亮度，更好的时间分辨率和空间分辨率；第四代是自由电子激光器。相比较于传统光源，同步辐射光源拥有高亮度、高准直性和高偏振等优势，并且覆盖了从远红外到X射线波段的连续光谱。
第二、三、四代同步辐射光源原理图
X射线由德国科学家伦琴在19世纪末发现，其拥有丰富的辐射-物质相互作用，包括吸收、衍射、散射和荧光等相互作用。基于此开发了一系列的实验方法：X射线吸收成像、X射线衍射、小角X射线散射和X射线荧光等。想要“看清”神经元、蛋白质和病毒等微小结构就需要选择波长较短的光。X射线波长短，是探索微观世界的重要工具。
基于同步辐射光源的X射线具有高准直性，可近似平行光入射，并且具有高纯净性，无杂质污染。同步辐射X光应用于神经元成像最大的优势在于其高亮度，第三代同步辐射光源的X射线亮度是X光机的上亿倍。这不仅提升了X射线的穿透深度，同时也减少了曝光时间，大幅度提升了获取成像数据的速度。
通过X-PCI成像后三维可视化的浦肯野细胞及分子层和颗粒层细胞
基于同步辐射光源的X射线成像
目前已有一系列基于同步辐射光源的X射线成像技术应用到神经元成像的相关研究中，其中应用最广泛的是硬X射线的相关技术。硬X射线的波长在0.01 nm到0.1 nm，相较于波长较长的软X射线，其具有更高的穿透能力。基于同步辐射光源的X射线相衬成像（X-PCI）、微米X射线断层扫描（Micro-CT）和X射线纳米全息层析成像（XNH）等相关技术在神经元结构的成像中发挥了重要的作用。
X-PCI技术利用软组织样品对X射线相位信息的响应，获得X射线对比度，从而实现对神经元的无标记成像。该技术对神经元的胞体以及浦肯野细胞等具有较好的成像效果，并可同时成像神经元和血管。近年来，有研究者利用X-PCI对无标记的人类小脑进行研究，对位于不同脑区的神经元胞体进行分布研究，并且从数据集中分割出浦肯野细胞。
XNH技术根据样品引起光束细微相移的变化来获取图像，并结合全息和层析重建来获取图像。该技术分辨率高，各向同性体素分辨率可以达到25 nm，且成像速度快，通过XNH技术可在12小时内完成各向同性分辨率50 nm的果蝇全脑成像。2020年，哈佛的研究者通过XNH扫描追踪了果蝇肌肉到中枢神经系统的单根运动轴突，证明了XNH的快速成像和追踪能力。
Micro-CT基于硬X射线吸收成像。由于硬X射线对高原子序数的元素有强吸收，而对碳、氢、氧等低原子序数的元素吸收很弱，所以利用Micro-CT对神经元成像需要对神经元染色。高尔基染色法的染液中含有汞、铬等高原子序数元素，对硬X射线有强吸收，从而拥有出色的X射线对比度。研究者通过Micro-CT在几分钟内完成了对果蝇大脑各向同性分辨率300 nm的数据采集，并在数天内完成了小鼠大脑的数据集采集。
通过Micro-CT成像后三维可视化的果蝇头部
除了上述技术之外，基于同步辐射的透射X射线显微（TXM）技术也可用于神经元成像。该技术采用空心环形光照明，空间分辨率和成像视场仅受菲涅尔波带片的限制。TXM的分辨率高且成像速度快，已有研究者实现了1分钟50 nm空间分辨率的纳米层析成像，并有分辨率小于10 nm的快速3D层析成像（85 分钟），这一分辨率已经逼近了电子显微镜常用的4 nm分辨率。目前，已有通过TXM观测神经元轴突和树突棘的报道，相信不久的未来，TXM技术将广泛应用于神经元成像。
同步辐射X射线成像是绘制“大脑地图”的利器
基于同步辐射光源的X射线成像相比较于其他三维成像技术有其独特的优势：
（1）同步辐射光源的X射线具有高亮度，这保证了其穿透深度，在此前的报道中发现其可以穿透数毫米的未透明化的脑组织块，降低了多组数据配准的工作量和难度。
（2）该方法具有各向同性分辨率，尤其是Z轴上具有高分辨率。光学成像方法中提高Z轴分辨通常需要减少切片和光学切片的厚度，使得采样的时间大幅度增加。
（3）该方法样品制备简单，无需对样品透明化处理和薄切片，通过XNH和X-PCI技术，还可以实现无标记的神经元成像，最大程度保证了样品的完整性并可用于后续的其他研究。
（4）向脑区注射病毒是荧光成像中常用的手段，但这不能应用于人脑中。基于同步辐射光源的X射线成像可以使用高尔基染色或锇酸染色，而此类染色方法可对死亡后的人脑组织进行固定和染色。不同于荧光成像，基于同步辐射光源的X射线成像无光漂白现象，并且可以长时间成像和反复成像。
（5）基于同步辐射光源的X射线成像获取数据速度快，就Micro-CT而言，成像速度目前最快可以达到1mm3/min组织，是目前成像速度最快的三维成像手段。
绘制人类“大脑地图”的机遇与挑战
绘制“人脑地图”是一个巨大的工程，现阶段无法通过单课题组完成。由中国上海光源（SSRF）、中国台湾同步辐射研究中心（NSRRC）、韩国浦项光源（Pohang Light Source）、新加坡光源中心（SSLS）、日本Spring-8光源、澳大利亚以及泰国光源等共同成立的大科学装置群的同步辐射神经科学亚太联盟（SYNAPSE），旨在绘制全世界首幅人全脑介观X射线连接图谱成像。以目前1 mm3/min的成像速度，十条相关同步辐射X射线成像线站协作，完成人全脑介观尺度X射线成像所用时间不到90天。
现阶段仍有一系列问题需要攻克，例如大数据的处理和配准、高尔基染色方法的改良等。先进的同步辐射大科学装置群的协作加上一系列染色、数据处理技术的支持和突破，绘制人类“大脑地图”将只是时间问题，基于同步辐射光源的X射线成像技术将是完成这一伟大工程的利器。
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本文作者汤乔伟是中国科学院上海应用物理研究所博士研究生；胡钧是中国科学院上海高等研究院研究员，基础交叉中心首席科学家；樊春海是中国科学院院士，上海交通大学化学化工学院院长、转化医学研究院执行院长；诸颖是中国科学院上海高等研究院研究员，基础交叉中心副主任