一、前言

细胞融合现象是1957年日本冈田善雄博士发现的。它是给动物细胞中加上HvJ（Hemagglutinating virus of Japan）病毒，病毒表面的受纳体即发生连接作用，使细胞与细胞凝集起来，产生具有两个或两个以上的核的细胞。这一技术后来应用于体细胞遗传学之类的基础科学，做出了很多贡献。

细胞融合技术最近引起了产业界的注目，其原因是：（1）1975年英国C. Milstein等人将此技术用于免疫学领域，利用淋巴球之类细胞和癌细胞融合的杂种细胞，培育成了单一特异性抗体。如后所述，这种单一特异性抗体有可能给临床诊断、治疗等医学领域带来革命性的发展，还有希望用作亲和色谱法的物质精制手段。（2）现在只能用作动物细胞的细胞融合法，也有可能用于植物及微生物细胞及其育种。在这方面尚有待于建立植物原生质体（剥去细胞壁的细胞）形成法，以及取代HvJ的融合促进剂的聚乙二醇表面活化剂的开发。

起初用作基础科学的细胞融合法，现在已经成为生物科学技术应用到各个方面。本文拟就用于动物、植物、微生物细胞时采用何种方法，可用于哪些方面作一些探讨。

二、动物细胞的融合及应用

动物细胞的融合不用任何前处理，只需加上HvJ或聚乙二醇即可使细胞相互凝集，细胞膜融合，形成融合细胞。人和老鼠那样非常悬殊的异种细胞虽可融合，但在该融合细胞培养中，几乎都有一方（在此情况下为人的）的染色体脱落。又如近亲动物细胞之间虽可获得稳定的融合，但哺乳类高等动物还不能由融合细胞形成新的个体。因此，细胞融合作家畜等的育种还是未来的事。现在最有希望的是使可在试管内无限繁殖的癌细胞，与在试管内难以长期培养的淋巴球等的细胞融合，获得杂种细胞。

淋巴球内有产生抗体的细胞（等离子体细胞）的前驱细胞的B细胞和调节免疫反应的T细胞两种细胞。其中B细胞和癌细胞融合起来的B细胞杂种在作无限繁殖的同时，分泌出单一特异性抗体。另一方面，T细胞和癌细胞融合形成的T细胞杂种中，也在无限繁殖的同时，分泌出与发现免疫反应与细胞性免疫反应有关的可溶性因子。历来用抗血清精制单一特异性抗体，或用T细胞大量获得可溶性因子都很困难。但是细胞融合技术可以大量生产这些有用物质。因而，现在世界各地都开始了这种杂种的应用研究。

1. 用B细胞杂种制作单一特异性抗体及其特征。

抗体为血浆中γ - 球朊属的蛋白质，由两个L链和两个H链构成。四个链按胱氨酸的氨基酸S-S结合结成。其中L链按特异性不同，由氨基酸排列不同的可变部分（VL）和特异性不同而排列相同的固定部分（CL）构成。h链则由一个可变部分（VH）和三到四个固定部分（CH1，CH2，CH3，CH4）构成。对于各种抗原的各种特异的抗体，因为基于这种L链和H链可变部分氨基酸排列的多样性，以及抗原结合部位立体结构的差异，像人和老鼠之类高等动物的多样性至少有106以上的形式。最近，对老鼠V，C范围用各种基因编出代码（据氨基酸排列顺序），查明V范围基因有数百种多样性。并且证明了，在自骨干细胞分化成产生抗体的细胞过程中，因存在于V，C基因之间的基因断片的组合，多样性又有增加。即：在L链中因几百个V基因和四个J基因组合，产生数千种多样性；H链上的V，J基因之间因存在D排列，还会产生数万种多样性。抗体特异性由VL和VH两方面决定，故全部多样约有107 ~ 108种之多。

从如此多的多样性的抗体中，仅选出一种和抗原作特异结合的抗体进行大量生产，这种杂种细胞的单一特异性抗体生产技术，不能不称之为真正的革命的技术。

这一技术出现的背景如下：上述DNA重组多样性是在骨干细胞→B细胞→产生抗体的细胞的分化过程中产生的。已知分化出的一种产生抗体的细胞仅分泌出认识一种抗原决定基的单一特异性抗体。因此，取出一个产生抗体的细胞作试管培养，可获单一特异性抗体，但这些细胞很快死去，所得抗体极少。另一方面，产生抗体的细胞癌变了的骨髓癌细胞可在试管内繁殖，并在培养液中分泌出大量的单一特异性抗体，但在多数情况下，也有特异性不明、无实用价值的。Milstein等人使老鼠的骨髓癌细胞和经目标抗原刺激过的老鼠淋巴球相融合，分泌出目标的单一特异性抗体，获得了可在试管内繁殖的杂种细胞。

具体做法是用目标抗原对动物做数次免疫后，取出脾脏细胞，使之与骨髓癌细胞混合，加上聚乙二醇，此二种细胞即行融合。用加有次黄质、氨基酸蝶呤、胸腺啶的HAT培养基进行一到二周连续培养，即有选择地祗生长出融合杂种（骨髓癌细胞若受氨基酸蝶呤的de novo DNA合成障碍影响，则不生长）。

单一特异性抗体有以下特点：

① 一般抗血清为有各种特异性抗体的混合物，欲提高其特异性，必须进行除去非特异性的吸收操作；而单一特异性抗体是纯粹的，本身就是特异性很高的抗体。

② 在试管内培养杂种细胞，培养液中可蓄积数+μg/ml抗体；注射至动物腹腔内，使之形成腹水癌繁殖，则每一只老鼠可获100 ~ 200 mg的抗体。从而，可以以过去不能相比的量制造抗体。

③ 杂种细胞用液氮冻结保存，多少年后仍可生产同样特异性的抗体。

④存在于细胞、病毒等表面的抗原、受纳体等可以分子级分析。

如 上所述，单一特异性抗体具有抗血清所没有的特点，它正作为基础科学研究的划时代的方法被采用着。在企业化上今后可应用的方面如下。

2。单一特异性抗体的应用

可以很快企业化、最有希望的是用作诊断剂。对于人的疾病诊断目前广泛使用血液及尿中含有激素、酶、蛋白质等的定量分析。其中尤以利用这些物质的抗体测定法，灵敏度、特异性、精密度等都很优越。但是所用抗血清是各种抗体的混合物，是一种非特异的结合，给特异性及灵敏度带来不良影响。对于癌抗原等的诊断还会出现假阳性。这些问题均可用单一特异性抗体解决。其次，单一特异性抗体可以大量制造，比兔等的抗血清成本低，单位产品也很齐一。用单一特异性抗体作临床诊断剂，在美国已有该抗体科研和制造单位向食品及药物部申请注册，目前已被批准用作某些过敏诊断及使用抗前列腺产生的酸性磷酸酶的前列腺癌的诊断。今后日本也将在一些临床诊断上改用单一特异性抗体。因为单一特异性抗体可以识别抗血清不能识别的癌抗原和病毒表面抗原，故而还具有开发新的癌诊断药物及病毒辨别的潜力。现在正在制造对人的主要组织适合性抗原HLA的单一特异性抗体，它不仅可以查清移植时'的组织适合性，而且可以预测易罹何种疾患，作用将超过血型检验。

其次是用于治疗。抗体本来是生物体的一种防御机构，在血液中循环，识别“我”与“非我”，并排除“非我”制造针对某种病原菌的单一特异性抗体，将会产生极好疗效。斯坦福大学的R. A. Miller等人给白血病及淋巴瘤患者使用人的T细胞的白血病细胞的单一特异性抗体，取得了良好的疗效。有一种称作“导弹疗法”的治疗方法、使针对癌的单一特异性抗体与毒素及抗癌剂相结合，用这些毒素及制癌剂，有选择地单一杀死癌细胞，已在动物实验中取得良好效果。在癌以外的疾患中，单一特异性抗体还可用于自我免疫及内脏移植时拒否反应的抑制。用老鼠细胞制作的单一特异性抗体有可能产生过敏反应，当然以用人的细胞制作的为佳。现在，使人的骨髓癌和淋巴球融合，已经制成人类的单一特异性抗体。

第三种应用是使单一特异性抗体与各种载体相结合并封装起来，用于精制亲和色谱法的物质。亲和色谱法现在只能在研究室使用，单一特异性抗体可使之在工厂规模使用。最近，英国半官半商的Celltech开发公司将干扰素精制用的单一特异性抗体封装制成产品，引起了各方面的注意。干扰素一次通过亲和封装，可获5,000倍的精制品。今后也有希望用于遗传基因操作中大肠菌等细菌制作及激素等有用蛋白质的精制手段。

3。T细胞及其它细胞融合的应用

T细胞调节免疫反应，分泌各种可溶性因子。低是存在量极微，精制困难。现在正在试验使T细胞与T细胞产生的溃疡融合，制作T细胞杂种细胞，用来大量生产可溶性因子。日本也产生了与过敏有关的Ig E抗体中特异的抑制性因子，得到了老鼠细胞杂种细胞。最近又产生了可溶性因子之一的T细胞繁殖因子（TCGF），制成了人的T细胞杂种细胞。这种可溶性因子今后很有希望用于自我免疫疾患及创造出全新的癌疗法。

将分泌产生激素细胞等生理活性物质细胞与癌细胞融合，制造产生这些生理活性物质的杂种细胞，依靠大量培养以批量生产也在试行中。

三、植物细胞的融合及应用

植物细胞有全能性（totepotency）。用适当的分化培养基培养一个植物细胞，该细胞能够分化成根、茎、芽等，形成原来的植物体。因此，植物的细胞融合不止于细胞，而是可能形成杂种植物，它在今后农业领域里将是广泛地应用于重要的品种改良、育种等方面的技术。如今利用有性生殖的杂交法可以制成兼备双亲特性的杂种，但有受精及胚发生阶段的不亲和问题，很难获得种间、属间杂种。与此相对，细胞融合法可使异种间体细胞融合，可以制造出迄今为止的杂交法不能得到的属间杂种。

1。细胞壁问题

由二层脂质构成的植物细胞膜的外侧、包着厚厚的细胞壁，不能直接融合。制造杂种植物，须经以下四个步骤。

① 用分解酶除去细胞壁，形成只有细胞膜的原生质体，② 二种欲融合的细胞的原生质体经聚乙二醇处理，融合，③ 融合了的原生质体移至再生培养基内，使细胞壁再生、繁殖，④ 将分化状态的细胞移至分化培养基，使形成具有根、茎、叶的植物体。现在植物细胞还没有像动物细胞那样用HAT培养基的选择法，为了选择杂种细胞，必须使用营养要求及耐药性等基因标志，或在形态上予以识别。

2。植物细胞融合用于育种

最近德国利用西红柿和马铃薯的原生质体融合，培育出属间杂种植物体“柿薯”。此外，还获得了豌豆和向日葵的杂种。这样，细胞融合法不仅可用于有困难的授粉，若也能用于有性杂交的种内、种间杂种，则将使育种更为有效，更快。将可以增加各种农作物单位面积产量，或赋予作物耐寒、耐盐、耐病特性，扩大栽培地区，提高粮食生产。还可成为制造味和香的品种、改良质的有效方法。

植物细胞也可应用重组DNA方法，给正在开发的系统作出补充。最近已经查明，寄生在植物体内、形成“虫瘤”的土壤菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti自繁基因、稳定地组入植物细胞DNA内。今后若能将有用的基因组进此自繁基因，则可能成为一种优越的育种方法，从国家角度上看，和细胞融合法同样有研究必要。

四、微生物细胞的融合及应用

微生物已经研制有大肠菌、枯草菌、酵母菌酵母，最近放线菌方面也在开发宿主菌系。这些菌的最有效的育种、改良方法是基因重组。但是，必须开发宿主菌的细菌、放线菌、酵母及目前完全没有宿主菌系的霉菌、藻类的育种，却以细胞融合法简便有利。干扰素及胰岛素之类的目标物质，给一个基因以代码时，只要将该基因组入菌内，进入培养、提取条件好的宿主，即可发现。另一方面，耐热、耐酸、耐碱、耐盐、生长速度等特性受多个基因支配，在兼备这些特性的育种中也以_胞融合法为好。因此，今后将基因重组技术和细胞融合技术很好地组合起来，将是现在发酵工业用菌的改良，创造出全新机能的菌的极有效的方法。

1。微生物细胞的融合

微生物细胞膜外侧也覆有细胞壁，仍须形成原生质体再行融合。细菌、酵母、霉菌等细胞壁成分各不相同，应选择相应的细胞壁分解酶。融合仍用聚乙二醇，于再生培养基中使细胞壁再生，还原成原有的细胞形态。微生物融合细胞比植物的容易选择培育，可以预先按各种基因给予标记。

2。微生物细胞融合的应用

现在完全没有霉菌进行基因重组的菌系，因而细胞融合是育种上的重要手段。酱油酿造用的酵母菌有可能提高分解大豆蛋白的蛋白酶的活性。细胞融合也可能是啤酒酵母、日本清酒酵母育种的重要手段。未过滤的酱酒中的耐盐酵母与酒精发酵高的菌株融合起来，将会增加酱油中的酒精成分。

五、结语

细胞融合技术一般比遗传基因操作技术需时少，操作简单。实验设备用普通的无菌室即可，也不需要遗传基因操作上必需的设备。从安全性考虑，这是因为细胞融合很少在实验室内制成对人体有害的细胞。动物细胞融合绝对不会出现单性。可以制出人和老鼠的融合细胞，只是在培养中人的染色体脱落。利用融合细胞创造单一特异性动物还未成功。用细胞融合作植物毒素生产株（如药草等）的快速生长株育种，其毒素不会自行进入人体，仅需处理时留心即可。微生物细胞危险的病原菌及毒素生产菌的融合也很安全。其次，细胞融合法在用于产业时，也没有遗传基因操作那样的基本特许问题。使用聚乙二醇不触及特许。细胞融合法比遗传基因操作历史久，但只在最近才开始应用的研究。预计今后将广泛地应用于医药工业、农业、食品工业、化学工业、发酵工业等各个领域。

[现代化学（日），1981年11期]