可以利用特异探针的核酸杂交技术，测定诸如HIV – 1 - 类的难以捉摸的传染因子。可用Q - β复制酶把特异探针进行千百万倍的扩增。

为了测定HIV - 1之类致病的还原病毒，必须研究出非常灵敏的分析方法。因为周围血液中万分之一的单核细胞就可使无症状的个体被传染，而且受传染人的血液很容易传染他人。适当的分析，需使用寡核苷酸探针，因为探针可和HIV - 1的核酸形成特异而稳定的杂种分子。这种分析方法的灵敏度，在于和靶结合后的探针的测定能力。传统的办法，是把荧光分子或放射性磷酸基之类的指示基因加入探针中。

再就是把过氧化物酶或碱性磷酸酶连接进探针中后，和无色基质一起保温，形成大量有色产物。但实际的测定范围，限制在约200，000个靶分子，这对于测定在含单一感染细胞的样品中存在的HIV - 1mRNA的6，000个分子显然是不足的。

可扩增的探针

对极少的靶分子进行测定的一个引人瞩目的办法，是把每个探针和报告分子连接起来，杂交之后，报告分子被成幂的扩增，从而显示探针的存在。我们发明了一种和该法互补的新技术，在可复制的RNA顺序内包埋探针顺序。如一般探针一样，把形成的重组体RNAs杂交进靶顺序内；然后，可从非杂交的探针中，把探针一靶杂种分离出来，如一般杂交分析一样。

重组体RNA探针的独特之处，在于当和RNA指引的RNA聚合酶Q - β复制酶一起培养时，它们能被成指数地扩增。在简单的30分钟反应时间内，能够合成的每一可复制探针的拷贝数多达千百万个。Q - β复制酶以其本身的RNA为模板，复制活动高度专一，确保只扩增可复制的探针。通过插入染料如溴化乙锭的荧光，能很容易地定量测出所合成的大量拷贝。因为极少的可复制的RNA简单分子就能起动指数扩增，所以我们的这项技术，为发展极敏感的分析程序开辟了光明前景。

两项技术促使扩增计划成为现实。发现可在一个小顺序中插入寡核糖核苷酸，自然出现Q - β复制酶的模板，MDV - IRNA，不影响它的复制性；当把它和T₇ RNA聚合酶在体外一起培养时，含MDV - 1cDNA顺序的一个质粒，可有效地作为MDV – 1(+)RNA合成的模板。质粒的MDV - 1顺序内插入探针顺序，形成了可用作可复制探针的模板，

在使用指数扩增技术探测分析特性的过程中，业已利用了含有插入HIV - 1探针须序的重组体RNAs。在一种促溶盐硫氰酸胍的溶液内，可复制的HIV - 1探针被有效探交进靶分子中。通过基于须磁粒子的反向靶捕获，能够把形成的探针一靶从非杂交的探针中分离出来。然后可复制的探针脱离开它们的靶，并借助Q - β复制酶起到复制模板的作用。复制作用的动力学分析结果显示，反应过程中的RNA分子数以定期间隔加倍，直到它和复制酶相等为止，起动反应的探针数越少，达到平衡点所花费的时间就越长，平衡以后，RNA分子数成直线增加。有两种不同的方法判断扩增结果。如果是对指数期的反应进行监测，那么在样品中出现的靶数的对数和合成任意扩增量的RNA所需时间之间，呈反直线关系；如果是对RNA分子数成直线增加时的后来反应进行监测，那么在样品中靶数的对数和任意时间时特异合成的RNA量之间出现正比关系。可以利用两种情况下相互关系的对数性质，定量地评价远越出正常范围的样品中的靶数。

分子开关

虽然探针 - 靶杂种经过了广泛冲洗，但是用扩增技术所能测出的靶的最低限量，仍受到残余探针 - 靶杂种的影响。结果，一般限于一万个靶子。为了使本底降低，构建了含有一个“分子开关”的重组RNAs。开关是在探针和靶杂交时，形成的一个改变了构型的探针分子区。例如，在两个相互配对形成发夹茎的较短互补顺序之间包埋一个探针时，便形成一个分子开关。当探针须序和靶杂交时，较长和形成复式的弯曲抗性把发夹茎中的顺序压成单股构型。

在这个例子中，分子开关选择的顺序形成了一个核糖核酸酶Ⅲ的双股识别位点。当探针顺序和靶杂交时，消除了核糖核酸酶Ⅲ的结合位点，因为互补顺序受力后分开了。把探针一靶杂种和核糖核酸酶Ⅲ一起保温，造成非杂交探针的选择性破坏。

依靠靶的复制

另外，通过利用不可复制的探针，可以消除因非杂交探针的残留所形成的本底。在该项设计当中，利用了一系列酶步骤合成了可复制的RNA指示分子。利用了两个不同的单股DNA探针。第一个DNA含有一个T₇启动区顺序（p），MDV - 1顺序的左边部分和—个探针顺序（a）。浅探针和其靶（a'）杂交以后，通过用适当的DNA聚合酶一起保温，它作为自身扩伸的模板。扩大了的顺序包括靶区的一个拷贝。

然后扩大的第一个DNA从其靶中释放出来，并杂交进含MPV - 1顺序右边部分的第二个DNA内（中间图），而且探针顺序（c'）和第一个DNA的扩伸顺序互补，然后，通过和DNA聚合酶一起培养，第二个DNA作为自身扩伸的引物。只有当两个探针都和其预期的靴子杂交时，才能形成一个具有功能的双股启动区（P和P'），这些DNA复合物和T₇ RNA聚合酶一起保温，合成了可复制的重组体RNAs。

通过和Q - β复制酶一起培养，转录本被成幂地扩增。因为非杂交的DNA探针是不可复制的，信号的形成取决于靶子，而且可以测出极少量的靶子。这种设计的另一突出特点是，扩增的RNA含有靶区中的一个顺序拷贝，可进行随后的等位基因分析。

[Nature，第339卷第6223期]