通过培养细胞再生植株是植物生物工程的一个重要组成部分。禾本科植物的细胞和原生质体培养再生植株的发展，以及基因的转化，给遗传基因调控和改进粮食植物提供了机会。

生物技术已经成为动物、植物和微生物细胞基因调控的一种先进而有力的工具。一般认为，这些从细胞和分子生物学发展而来的技术，将具有潜在的应用价值。生物技术的商品已在市场上出现，它们包括有价值的药剂、疫苗和诊断探针等等，这些项目是建立在微生物和动物体系成功的基础之上的。因为我们缺乏有关植物的生长、发育和分子生物学方面的知识，因此，植物生物技术落后于微生物和动物体系的发展。自然，植物生物技术也就难以给我们提供一种具有重要商品或农业价值的改良植物或植物的产物。

谷类植物除了提供动物食物外，还提供了世界上一半以上的食物给人类。显然，提高谷类植物的产量或质量将具有世界范围的影响。和其它禾本科植物一样，进行谷类植物的离体操作一般比较困难。本文将介绍近十年来在细胞培养和基因调控方面的一些重要进展。

从组织培养再生植株

在60年代和70年代，随着植物细胞和组织培养方法的增多，人们已开始着手于研究许多重要的作物。而合成生长素，如2、4 - D在愈伤组织诱导过程的应用，加速了禾本科植物的研究过程。在早期的工作中，由于使用相对成熟而复杂的外植体，因此限制了植株的形态发生的表达。禾谷类植物在分化和衰老过程中再生能力消失很快，这种消失看来与植物体内生长调节的水平有关。因而，幼嫩组织和分生组织的诱导培养，使植株的再生更加有效了。识别在离体条件下不同类型的愈伤组织，以及选择转接那些具有较大植株再生潜力的组织，将有助于进一步提高植株的再生能力。

许多愈伤组织的形态发生已经在文献中描述过，其中最常碰到的愈伤组织是疏松易散的，由根或苗外植体的分生组织产生的大而液泡化的细胞所组成，它们大多数发育成根，苗的再生是偶然和短暂的，因此，这种培养受到了限制。与此相反，在由具稠密细胞质和活跃分裂的细胞组成的紧密愈伤组织中，可观察到苗的高频率的再生，这种愈伤组织只能从具有大量分生组织的外植体中获得，如未成熟的胚的小盾片，幼嫩的花序组织和幼叶基部。这种愈伤组织经过长时期的培养之后，其再生能力不会衰退。这种培养大多是通过胚胎发育形成植株的，培养的愈伤组织称为Ⅰ型愈伤组织。通过苗的发生形成植株时也可以产生Ⅰ型愈伤组织。Ⅱ型愈伤组织则疏松易散，一般是自发和偶然发生的。几乎在所有物种中，产生紧密胚性愈伤组织的部位，至今还没观察到有Ⅱ型愈伤组织。

一般来说，愈伤组织对于以转化为目的的基因工程并不适宜，因此，细胞悬浮系统和原生质体系统的建立是必须的。禾谷类叶肉细胞原生质体的培养还不可能，但建立良好的分散均匀的悬浮细胞系统是非常重要的，这样可获得能分离的原生质体。这种培养从胚性愈伤组织开始，也可以再产生胚状体，这样培养的原生质体保持了胚状体发生和以后形成植株的能力，

组织培养再生的植株经常在表型和基因型上与原来的植物有差异。体细胞无性系的变异作为培养中诱导变异的表现，已在文献中有很好的记录。其中一些变异在外植体中就可观察到，并且通过组织培养过程再现。非整倍性变异（染色体数不是单倍体数的整数倍）、整倍性变异（染色体数是单倍体数的整数倍）、染色体的结构变异以及单个基因的突变，在不同的植物中都有发生。子代的自我再生一定表现出不同表型的遗传力。不过，尽管通过了广泛的研究，几乎没有几种细胞培养的回覆变异具有农业价值。我们无法期望通过体细胞无性系的变异来产生一种重要的作物物种。通过离体选择产生的突变植株，对农作物中重要基因的分子水平的了解有很大的帮助。

在胚状体发生培养中观察到的变异比起器官发生培养来说相对少一些，但在体细胞胚形成过程仍需进一步挑选出畸形细胞。比起胚状体的发育，苗的分生组织发育可能受到基因紊乱的影响更小。合子和体细胞胚的形成和成熟要求排除大量突变的积累。许多在特定阶段抑制胚胎生长的致死突变体已在玉米等禾本科作物中分离到，一些突变体的表型与异常体细胞胚相似，这可能为控制胚状体的形成提供线索。

细胞融合和DNA直接吸收

当今，农产品的生长要求不断地开发出新的农作物来适应当前经济的变化增长、消费的喜好以及有规律的调控。像其他一些影响投入量和产出量的性质一样，对抗病、抗虫和抗除莠剂基因的修饰可能是培育的方便途径，另外还加上细胞培养和转化技术，可不断产生新的变异。在自然条件下，种间隔离的物种很少传递遗传信息。通过原生质体的融合可产生广泛的杂交。禾本科的基因操作最大阻碍在于从原生质体再生植株。目前，仅有几种禾本科植物的再生成为可能，其中包括甘蔗、稻和玉米。一般说来，原生质体是从正在快速生长的分散均匀的胚性细胞悬浮液中分离得到的，而分化的叶肉细胞原生质体（在许多双子叶植物中是获得再生植株的一种理想途径）却不能再生的根本原因还不清楚。在分化的叶细胞中DNA的降解或丢失还没有具体的报道。

体细胞杂交和胞质杂交

由于合适的原生质体系统研究的进展缓慢，禾本科植物体细胞杂交的发展而被延误。在早期的一些原生质体融合实验中，用大麦和玉米的叶肉细胞原生质体与从细胞培养获得的双子叶植物细胞的原生质体融合，异核体（原生质体融合后保持有从不同亲本来源的核）可以明显地从绿色和无色的质体的出现来辨别，但其分裂一般是不成功的，现在这种绿色和白色原生质体广泛地作为异核体的手工选择或流式分选的标记。禾本科与双子叶植物的融合体经常能发育成为小的克隆系，但没有愈伤组织发生，最近更多使用的形态发生和生化方面的标记，能分离出杂交的水稻——胡萝卜细胞系以及水稻——大豆细胞系，其中，水稻的遗传信息是局限性的保留。水稻——大豆杂交系愈伤组织能从形态发生（大豆的愈伤组织松软）以及颜色（水稻的愈伤组织含紫红色色素）上来挑选，同工酶和部分蛋白质的分析表明，水稻的核基因被丢失了，但其中的白色愈伤组织可能同时保留了水稻和大豆的叶绿体。在水稻——胡萝卜杂交系的选择中，水稻的原生质体在一定培养条件下并不分裂，却对铃兰氨酸有抗性，与胡萝卜原生质体融合后生长在含有A2CA的培养基上，通过具有完整胡萝卜DNA的水稻DNA的斑点印迹分析，把水稻和杂交细胞系比较，表明只有大约7%的水稻基因出现在杂交种中。没有证据可以反驳混合体或嵌合体细胞系存在的可能性。

禾谷类植物属间杂交的细胞系最近也已产生。抗S - 2 - 氨乙基半胱氨酸的珍珠谷（pearl millet）的细胞株系的原生质体用代谢的抑制剂，如碘乙酸浓缩处理能完全抑制其细胞分裂。把大黍（羊草）甘蔗成单果小麦的悬浮培养系获得的原生质体与不活跃的原生质体融合，杂交愈仿组织在含AEC的培养基上筛选，杂交特性可通过乙醇脱氢酶和6 - 磷酸葡萄糖脱氢酶的同工酶分析来确定。属间杂交出现的异核带似乎表明愈伤组织是杂交形成的，而不是嵌合体。羊草和甘蔗的胚性细胞悬浮培养已经在融合实验中运用。珍珠谷——羊草细胞系没有形态发生，珍珠谷——甘蔗细胞系能产生杂交体细胞胚，但未发现有植株。水稻和稗的原生质体融合也能产生体细胞杂交的植株，与用碘乙酰胺处理后不能分裂的稗类植物融合后，水稻的原生质体变得不活跃了。大多数克隆都是杂交形成的。植株的再生也可能从杂交的愈伤组织而来。

胞质杂交是细胞融合后，核与细胞质之间的重组得到。大多数植物细胞质是母性遗传，因此，没有机会使一种物种的叶绿体与另一物种的线粒体重新组合。在体细胞杂交中，带有雄性不育基因的线粒体能与含有抗除莠剂基因的叶绿体重组。好几种双子叶植物也有同样的实验结果。许多事实表明，一种物种的叶绿体可能很快丢失，而线粒体DNA的重新组合和排列是很常见的。单子叶植物还没有类似的性质，因为还没有获得成熟的体细胞杂交植株。尽管如此，线粒体DNA的重新排列已在好几种杂交细胞系中观察到，属间杂交还没有建立以上重排的基础，但亲本一定顺序的扩增已经有论述了。

转 化

植物细胞在自然状态下外源DNA的转化，发生在土壤杆菌的感染过程中。根瘤土壤杆菌诱发冠瘿病，发根土壤杆菌引起发状根的病理紊乱，病原体的宿主范围限制在双子叶植物和裸子植物类。大质粒（Ti：瘤诱导质粒，Ri：根诱导质粒）的一个片段（T-DNA）能转移到植物的DNA中。T-DNA保留了调控植物激素代谢基因以及调控作为细菌营养物的特殊化合物（冠瘿碱）合成的基因。大多数用以操作植物细胞基因的质粒是经过修饰的，与激素代谢有关的基因已被去除或被标记基因取代，如氯霉素乙酰基转移酶、二氢叶酸还原酶 - 葡糖苷酸酶和水囊瘤素磷酸转移酶。嵌合体基因由与5' - 上游顺序启动子和3' - 下游顺序相连接的密码子区所构建，而且能控制短暂的表达过程以及选择稳定的转座子。

土壤杆菌的转化实验已经在百合科和石蒜科等单子叶种中有报道。双子叶种类感染后有大量的冠瘿产生，而单子叶种类则不同，在吊兰和水仙属中只观察到有少量的肿瘤突起。感染植物产生的冠瘿碱的性质可在植物组织中检测。石刁柏茎段的肿瘤扩增可在不含激素的培养基上发生。禾本科的玉米也有类似的结果报道。T-DNA进入植物并与植物基因结合的情况还没在任何单子叶植物中证实。

土壤侵染（Agroinfection）是一种测定玉米被土壤杆菌感染的灵敏方法。这种最近才发展起来的方法利用了土壤杆菌与入侵的病毒基因之间的T-DNA的边界顺序（这里的病毒指的是玉米条纹病毒）。感染几天后，玉米在注射位点的周围出现病毒感染的症状、玉米条纹病毒DNA在感染的植株中出现，在没有感染症状的植株中则不出现。没有病毒感染的植株注射了病毒DNA或土壤杆菌后，将保持有肿瘤诱导的—种缺乏T-DNA边界顺序的质粒。至今还没有证实T-DNA与宿主植物细胞的结合是病毒感染的先决条件。对黑麦完整植株实用的另一新技术，已在植物的转化基因水平上有了成效。将具有抗卡那霉素选择标记（NPTⅡ基因密码控制）的质粒DNA注入花期成熟前的幼嫩分蘖中，处理过的植株经过交叉传粉（Crosspollination）结出的种子能在含卡那霉素的营养液中发芽。两种抗卡那霉素植物DNA分析表明，导入的NPTII基因（NPTⅡ：neomycin phosphotransferase Ⅱ）的顺序是同源的。尽管这看起来是一种简单的技术，但为了转化成功，获得花生长发育的确切知识却是必须的。更进一步，这些结果已通过对转化植物的亲本分析，证实和建立了抗卡那霉素转化基因的孟德尔遗传规律。现在开始用于谷类植物的新方法，是利用微型注射和飞弹转化。目前，从芸苔的小子孢中得到胚状体通过微型注射获得了基因转化植株。这种新颖的方法可能对直接传递DNA到再生细胞株系、合子、体细胞胚、苗分生组织、花原基等等，是非常有用的。尽管在多细胞结构中一个或更多细胞的转化趋向于只产生一种嵌合体，但通过自身繁殖而获得纯系的转化植株并不太困难。

目前，禾本科中有农业价值植物的生产被两个因子限制了。首先，转化的原生质体和细胞再生完整植株的能力有限，第二，有农业价值的重要基因几乎没有认识或者克隆。期望这些领域中?^快的进展，能增强禾谷类植物对除莠剂的耐受力（通过与抗Glyphosate或抗Chlorsulfuron基因的结合）、对病毒的耐受力（通过融合病毒外壳蛋白基因），以及对昆虫的抵抗力（通过结合芽孢杆菌的毒素基因）。这些被单个基因控制的性状操纵，相对来说是简单的。与此相反，大多数有农业价值的重要基因，如控制产量、质量、耐盐力等等基因是多基因调控的，这些基因不是没有查明认识就是分子水平没有掌握，因此，直接的多基因的传递、结合和表达都更显困难。

结 论

近10年来，禾谷类植物的离体再生和基因调控已经得到了显著的发展，更进一步的发展将建立在培养原生质体成功的基础之上，这工作包括原生质体的再生，以及像细胞/组织/器官的完整再生一样，获得高频转化的原生质体。植物的生长、发育的调控和基因的结构、功能、表达方面更详细的研究，必将成功地为植物细胞的分子操作提供坚实的基础。

[Physiologia Plantarum，73，1988]