发展了10多年的哺乳动物细胞转移基因治疗法能够治疗人类疾病。在基因治疗前应注意关键性的技术问题，并保证安全有效地应用于临床。基因转移和细胞移植技术为基因治疗能够成功地应用打下了坚实的基础。

DNA重组技术在临床应用上有明显的进步。新分子技术可诊断或治疗特殊遗传病。DNA重组技术解释了由特殊基因引起的人类疾病的致病机制。

基因治疗的理论是，把遗传物质转移到病人的特殊细胞中，这样就可治疗人类疾病。这是DNA重组技术的简单和直接的应用。研究表明，基因转移在临床上能够成功地应用。

一些基因治疗的研究文章表明，基因治疗中的一些主要技术问题严重地影响了在临床上的应用。本文介绍了解决这些问题的方法，且提出了研究分析问题的新领域。

基因转移技术的发展

基因治疗的关键是相应靶细胞的转导，基因转移方法是各种治疗方法的研究中心。这些治疗方法共同特征是把基因有效地转移到细胞中去。经反录病毒载体和腺病毒相关病毒载体把转移DNA序列稳固地嵌入靶细胞DNA染色体中。体内基因治疗常用载体，从体内分离到相应靶细胞，体外细胞转导后，再把修饰细胞输入病人体内。基因转移的其它方法都是把DNA序列转入细胞核。这些方法效果佳，但持续时间短。体内基因治疗主要是依靠基因表达。把遗传物质直接转移到病人的细胞和组织中。现在主要介绍采用这些方法把DNA转移到细胞中的结果和特征。

反录病毒间介基因转移引起一些载体停止对100%靶细胞稳定转导。

反录病毒间介基因转移是基因治疗在体内的应用。基因转移方法在体内治疗的特点是：

1. 反录病毒进入细胞后，主要依赖靶细胞中的相应病毒受体生存。研究人员在严重感染细胞中发现，病毒包装细胞系会引起宿主细胞变异，存在的问题是部分转导特异性细胞型（如，造血干细胞）不能引起相应病毒受体表达；

2. 靶细胞复制是与前病毒结合的。近来研究表明，病毒结合是由有丝分裂决定的。如，基因转移是由短期内靶细胞增殖功能决定的。

反录病毒粒子比其它病毒容易变异。提纯反录病毒可引起明显的感染症状，病毒env产物也会引起损伤。另外，灵长类动物体内两亲性病毒经补体调节过程可快速灭活，不稳定性反录病毒粒子和非活性反录病毒能与非复制细胞相结合，因此，反录病毒载体在体内转导困难。

反录病毒载体是在特异细胞系中发育（称包装细胞），复制缺陷重组病毒和自由野型病毒效价高。包装细胞能够转移非遗传信息病毒产物，转导细胞对其它细胞不能持久性感染和传播病毒。由病毒衣壳表面蛋白质密码转录发现，在活性包装细胞系中有特异性相应标记细胞系。

在体内基因转移中，腺病毒载体是很重要的。腺病毒能感染不分裂的细胞，并使大量基因表达，提纯病毒粒子是相对稳定。腺病毒感染后，包装细胞会溶解细胞。腺病毒DNA序列和靶细胞染色体DNA结合能够感染非包装细胞。

申克（Shenk）及其同事发现，在细胞生长过程中腺病毒载体的E1基因可表达。研究表明，缺陷腺病毒基因组可载外DNA序列。腺病毒载体能运载缺失的病毒基因组E1A-ElB和E3区。启动基因可启动嵌合序列的表达，主要晚启动子（MLP）伴有引导序列、E3启动子或外源性增强启动子序列。

在体内基因治疗中，腺病毒载体会产生大量基因产物。在各种组织中病毒伴有载体调节的基因表达。体内多数细胞有转导功能，基因表达是持续性的，在复制中E1区表达会影响其它病毒基因表达，E1基因表达不参加病毒复制。E1基因载体（腺病毒）早期特点：感染率高，E1区不复制，正常复制周期慢。

重组病毒复制低，基因持续表达。活E1缺陷腺病毒基因组是依靠特异细胞基因产物表达和细胞增殖来复制。靶细胞的性质决定了体内腺病毒复制能力。人特异细胞内腺病毒载体有复制或使基因持续表达的功能。

腺病毒生活周期中，多数基因产物不能持续表达。另外，基因表达可抑制蛋白质合成和基因产物（包括恶性变异）表达。腺病毒感染会引起直接抗细胞的强免疫反应。

腺病毒相关病毒（AAV）、疱疹病毒、牛痘病毒和—些RNA病毒都可做载体。AAV相对较小、稳定，并可感染人细胞。AAV基因组前后小片段常出现缺失和重新排列。野型AAV基因组能与人染色体小区结合；AAV也可与非分裂细胞结合。

疱疹病毒载体把外DNA固定在中枢神经系统（CNS）细胞中。由于病毒复制综合调节，重组病毒的遗传物质不会复制。复制不全的病毒可杀伤细胞。在毒素感染的细胞中，病毒特异基因产物可表达。现在可以控制这种基因的表达。

在靶细胞内毒复制和基因产物表达都是应用于基因治疗。载体是牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒和其他RNA病毒衍生来的。

非病毒基因转移方法是哺乳动物细胞摄取和大分子细胞内转移。目前，受体调节细胞内容物的方法是摄取DNA、这种方法是把体内特异细胞型基因作为靶。基因转移受体调节方法能够综合遗传（质粒DNA和特异多肽配位子）和识别细胞表面受体。受体调节摄取方法是经细胞内含物把基因转移到溶酶体，核内体降解。腺病毒或流感HA基因能引起核内体DNA分裂。细胞DNA转移是受体调节细胞摄粒作用的结果，避免DNA转移到核内体。在部分细胞中，转移DNA序列的表达比配体DNA复合物更明显。腺病毒可加强转移基因靶的功能。

受体调节机制只是基因短暂表达。腺病毒载体是基因持续表达的分子基础。

基因治疗模型的发展

基因治疗的前期研究，是研究适应基因运载方法的技术问题和在相应疾病模型中治疗的安全性和有效性，这是各种治疗技术的应用。

由于疾病损害了造血细胞，造血干细胞转移和移植能够代替遗传修饰造血细胞。转导可延长干细胞周期。研究表明，致死量X线照射受体发现干细胞有再生功能，靶细胞是造血细胞。

检测表明，长期供给遗传修饰细胞，从骨髓移植受体能检测到自然造血细胞。先干细胞处理，只少数干细胞系转导，或病毒或细胞和病毒细胞（Virus-Producing cells）混合培养。5-氟尿嘧啶（5-FU）处理过的骨髓细胞、生长因子干细胞和病毒细胞混合培养。在骨髓移植受体中病毒会复制，100%造血细胞都会重组前病毒。在体内造血细胞中基因能够表达。

狗和猴造血干细胞转导实验表明，骨髓移植受体会恢复遗传修饰细胞，且少数干细胞可转导。

基因治疗发展趋势是解决干细胞和骨髓移植生物学影响造血细胞持续转导的问题。提纯干细胞增殖功能用于研究干细胞转导。实验表明，骨髓移植和各种细胞都会影响造血细胞转导。

直接基因治疗肝病模型有ex体内和体内治疗模型2种。ex体内治疗和转导肝细胞方法都有发展，技术问题影响了肝细胞移植。最佳方法是把肝细胞注入肝和脾，异位移植肝细胞能增强识别功能。

各种实验的目的是体内基因治疗法在治疗肝病上的直接应用。腺病毒载体可感染肝细胞，反录病毒载体会感染转导肝细胞。体内基因治疗法是治疗肝病的趋势。

体内基因治疗肺病模型研究表明，腺病毒载体把基因转移到白鼠上皮上，7天时，大量细胞能转导和持续表达。海德（Hyde）等认为，这种表达是因CFTR转移到鼠系肺上皮和肺泡的结果。CFTR基因表达说明RNA位点杂交和离子转移。

近来基因治疗研究中心是原始细胞型移植。转导角质化细胞、成肌细胞和成纤维细胞移植都有进展。实验表明，转导细胞移植后，体内基因可持续表达。

基因治疗法还可治疗后天疾病。治疗癌症的关键是肿瘤特异淋巴细胞和肿瘤细胞的遗传修饰。转导肿瘤细胞能引起肿瘤特异性免疫反应，特异细胞质分裂和其它基因产物表达会引起肿瘤排斥反应。转导肿瘤细胞能启动非转导肿瘤细胞排斥反应，细胞质分裂和基因产物有抗肿瘤功能，且引起抗肿瘤反应。辐射肿瘤细胞GMCSF因子可治疗各种癌症。

其它基因治疗法也能治疗癌症，把肿瘤抑制基因转入肿瘤细胞，并抑制致癌基因表达，也将毒素基因转入肿瘤细胞。

基因治疗法可治疗AIDS病、心血管病和中枢神经系统（CNS）病。基因治疗AIDS病，主要是提纯细胞抗HIV感染。细胞内接种和病毒子代能抑制HIV感染。治疗靶细胞是T淋巴细胞和造血细胞。基因治疗心血管病，遗传修饰细胞是构成血管壁和心脏成分。基因治疗CNS病，主要方法是把遗传修饰细胞移植到脑不同区域。

[Science，1993年5月14日]