三位分子生物学家由于发现研究基因结构和控制的方法而获得诺贝尔奖

当前，诺贝尔化学奖的着眼点正由于方法论的革命，使得学者们能深入探索高等生物的基因控制和结构，这在过去是无法想象的。这项奖的一半授予斯坦福大学的Paul Berg；另一半分别授予坎布尼奇大学的Frederick Sanger和哈佛大学的Walter Gilbert。Sanger只是第二次获得诺贝尔奖。

Berg由于“对核酸的生物化学研究特别是对DNA重组的研究”而获奖；据报界发布的消息，瑞典皇家科学院认为：“Berg首次完成了DNA分子的重组也就是说使DNA分子内进了其它种属的DNA。他的开创性实验带来了通常称为‘遗传工程’的新技术。”Berg不知诺贝尔委员会的授奖是否由于他的某一个实验，他说：“我想这项奖金应该是属于整个工作，而不是个别的实验。”斯坦福大学的Arthur Kornberg认为，对于诺贝尔委员会的“措辞严谨的称颂”的唯一正确解释便是它承认了Berg二十年来在核酸的分子生物学方面的领先地位。

六十年代中，Berg在细菌的蛋白质合成方面做了大量开创性的工作，特别研究了氨基酸和转移RNA的相互作用。他的工作有助于解释DNA是怎样在解码中起作用的。他的研究小组及其他同事还发现了一种可将DNA转录成RNA的酶。

后来，大约在十年前，Berg和其他许多分子生物学家应用已知的细菌基因表达方式来研究更高级有机体的基因表达。Berg说：“我们那时开始尝试用SV₄₀（一种动物的肿瘤病毒）把基因引入到哺乳动物的细胞中去。”这样便可对外来基因进行研究和调节，看看究竟是什么控制着它们的表达。

1971年，Berg和他的同事David Jackson和Robert Symons用一种限制性内切酶（ECO. R₁）打开了环状的SV₄₀ DNA分子。这种酶是加州大学与弗莱西斯分校的海伯特 · 鲍耶实验室发现的。它能在特定的碱基顺序上裂解DNA，对SV₄₀来说，它只作用于DNA的一个位点上，然后，Berg小组再将呈线状的SV₄₀的DNA联接到细菌病毒λ的DNA中去。这样λ-DNA也是环状的，Berg小组也是用ECO. R₁酶来将它裂解。

尽管这是首次把两个不同种属的DNA联接了起来，但对DNA的联接却有过先例的。在六十年代，麻省理工学院的H. G. Khorana曾发现，由细菌病毒T₄产生的一种酶能使DNA分子联接起来。Berg，Jackson和Symons则用酶学方法促使两个DNA片段互补（粘性末端），然后用这种T₄酶去完成联接。这种方法分别由Berg小组和Reter Lobbom及斯坦福大学的Dala Kaister他们独立试验和发现。但在那个时候，人们都不知道，其实没有必要去做什么粘性末端，因为当ECO. R₁酶裂解DNA以后，也就自然形成了粘性末端。这个事实分别由Janet Merty，Ronald David和Vihorio Sgaramella在1927年发现。他们都是斯坦福大学的。

Berg当时企图把SV₄₀-λ杂交分子引入到它所感染的大肠杆菌中去。用这种方法，他便可得到许多复制了的分子，以便进一步从事哺乳动物细胞的基因表达研究。1971年夏天，Berg的研究生Mertz在纽约的冷泉港举行的肿瘤病毒会议上提出了这项计划。冷泉港实验室的Robert Pollack表示反对。他指出，SV₄₀能转化在培养中的人类细胞，而大肠杆菌则存在于人的消化道中。如果受SV₄₀-λ DNA感染的大肠杆菌从实验室逸出的话，那将是危险的。

Berg被这种论点所说服，停止了这项实验。在他们带领下，分子生物学家们提出了延期进行重组DNA的研究，直到对危险性作出定论，能确保实验安全为止。Berg回忆道：“那真是个论战多于科研的年代。”到1975年，这延期研究的决定被有条件地取消了。国家健康研究所订出了重组DNA实验的准则。但后来的实验证实，危险性并不如预料的那样可怕。这个准则也就不那么得到重视了。

说来也怪，Berg原先想做的那项实验倒并没有取得成功。但那时没人知道其中的奥秘。现在知道，这种杂交的SV₄₀-λ不能在细菌中复制是因为Berg把SV₄₀的基因插到了λ基因的重要复制位区，因而阻断了它的复制。

事实上，重组DNA技术的关键不仅在于粘接，还在于基因的无性繁殖。必须找到把外来基因引入细胞的办法，并保证基因能被表达。然后选择能表达这些基因的细胞。无性繁殖技术是由Stanley Cohen，斯坦福大学的Annie Chang，加利福尼亚大学圣弗兰西斯分校的Herbert Boyer和Robert Helling共同开创的。他们早在1970年就发现了一种质粒，那是一小段染色体外的DNA，能把外来基因携入细菌细胞中。这种质粒含有能使细菌抵抗四环素的基因。所以，带上这种质粒并能作基因表达的细胞可以很容易地被挑选出来。

在过去的十年里，重组DNA的技术逐渐趋向成熟。Berg在这过程中起了重要作用。最近，他和其他工作者，特别是约翰霍普金斯大学医学院的Danieel Nathans，对SV₄₀基因的结构、组成和复制进行了广泛研究。Danieel Nathans因研究限制性酶而获诺贝尔奖。后来，Berg搞出了SV₄₀缺损变异株，这对研究SV₄₀的基因功能是极为有用的；此后，萌发了早先的设想，即利用SV₄₀把基因引进哺乳动物的细胞。他把大肠杆菌的基因粘接到了SV₄₀中去，使得细胞能够在核苷酸的合成中用黄嘌呤作底物。后来，在一些不同的实验中他把动物的球蛋白、组蛋白、双羟基叶酸还原酶的基因粘接到这种杂交的SV₄₀的DNA分子中。当带有细菌或动物基因的SV₄₀被引入到培养的细胞中去时，Berg就能把由SV₄₀所转化的细胞挑选出来，因为这种细胞能在黄嘌呤上生长。用这种方法，Berg证实被引进的动物基因在培养细胞中得到了表达。

国家儿童保健和人类发展研究所的Dean Hamer和Philip Leder在培养细胞中也采用SV₄₀作为无性繁殖传递者（Cloning Vector）。不过，Nathans说：“用动物病毒来建立媒介的概念显然是Berg的思想。”

Berg工作的一个重要方面是他在发展方法学上的非凡才能。例如，他是第一个用硝酸纤维素结合分析法来研究蛋白质和核酸之间相互作用的。他并且发展了缺口转译方法（nick translation method）。这种方法是用来制备同位素标记的DNA探测剂，对于当前基因功能的研究至为重要。Nathans认为：“他的生化研究在核酸领域中是有建树的。”

化学奖的另一半也是授予方法论的建树者；Sanger和Gilbert由于发现了测定DNA顺序的方法而获此荣誉。在过去的几年里，这些技术被广泛用于测定蛋白质的氨基酸顺序。因为，用这类方法测定蛋白质的DNA编码顺序，要比直接测定蛋白质的顺序更为容易、准确。分子生物学家希望通过这些方法去了解是哪些顺序控制着高等有机体的基因表达，其过程又是怎样的。Gilbert说：“DNA的顺序是分子生物学的基础，再没有什么比这更重要了。问题的症结就在这里。”

Sanger和Gilbert这二位科学家大不相同。他们各自通过完全不同的途径进行DNA的顺序测定。Sange只是冷静、谦虚、自制的；而Gilbert则是火一样的性格。加利福尼亚大学圣地亚哥分校的Fed Friedman曾和Sanger一起度过一个休假年，他说道：“如果你和Sanger谈话而不知道他是谁，你真会把他当作实验室的看家人。你让他干任何活，他都会专心一意的。”牛津大学的George Brownlee直到前不久还和Sanger一起在剑桥工作，他也说：“自己尽管从不摆架子，可依我看来，他是我们时代的伟大科学家。”

根据Friedmen的说法，Sanger的卓越性格是他的“不可动摇的信仰和胆识，那就是DNA的顺序是可以用非常简单的方法加以测定。”在五十年代，Sanger研究蛋白质顺序，那时没有人知道是否相同类型蛋白质都具有同样的顺序。他的第一次诺贝尔奖就是出于此项工作。后来，他又专攻RNA顺序测定的问题，发展了广为采用的指纹图谱法。大约在十年以前，他开始从事DNA的顺序测定，尽管这个问题也同样被认为是很难对付的。

Sanger对这个问题的解决办法是从各个不同角度逐渐加以完成的。早在七十年代初期，Sanger就发现了用加减法来测定顺序，这就是他目前所采用方法的前身。加减法的目的是得到一整套依次递增的DNA片段来进行顺序测定。第一个片段里有第一个核苷酸，第二个片段里有第一、二个核苷酸而第三个片段里则有头三个的核苷酸，以此类推，所有的这些片断都具有这样的结构，即每一片断的最前一个核苷酸都一样是已知的。一旦得到了这一整套的片段，就可以按它们的大小不同，利用超薄聚丙烯酰胺凝胶电泳，加以分离。分离后的片段就可以根据同位素标记而进行鉴定。

加减法的关键是得到一整套依次递增的片段，Sanger用合成方法来获得。他分离了体测顺序的DNA二条链，然后，将其中一条链进行部分复制。为了确保部分复制的片断是依次递增的而每一片段的末端核苷酸是已知的，Sanger在复制时对某一核苷酸数量加以控制。比如说，他限制了腺苷酸的数量，因而DNA的复制最终会由于缺乏腺苷酸而停止。这样所有的复制片段就会在某个腺苷酸出现以前而中止。这些片段的下一个核苷酸就必然是腺苷酸。用同样的方法，Sanger合成了许多片段，分别在DNA的三种核苷酸出现前终止。

打那时以后，Sanger改进了加减法，使之更加有效。他用核苷酸的衍生物来代替用各个核苷酸的限量办法使DNA的合成中止。

和Sanger不同，Gilbert并没有意去测定DNA顺序。作为一个显然是很活跃的科学家，Gilbert领导着一个实验室，他在过去的二十年中涉猎很广：从细菌基因的构成和表达直到高等有机体的基因表达和遗传工程。他担任了基因粘接协会（Biogen）的主席和常务委员会副主席的职务。

Gilbert和Allan Maxam（此人现在哈佛医学校的Sidrey Farber肿瘤研究所工作）进行DNA顺序测定的技术研究几乎是偶然的。Gilbert回顾了在1975年初，苏联科学院的Andrei Mizabekov来到他办公室，极力催促他试验用新的方法研究蛋白质是如何识别出DNA的特定顺序的。Gilbert对于大肠杆菌的乳糖阻遏蛋白一直很感兴趣。这种阻遏蛋白与乳糖操纵子的DNA片段相结合。实际上是Gilbert把乳糖阻遏子和操纵子相分离。Mizabekov和他的同事们则一直试图用硫酸二甲酯——一种使DNA上的腺嘌呤和鸟嘌呤甲基化的试剂，来研究蛋白质和DNA相互作用。和二甲基硫酸作用后，DNA很容易在这些碱基上断裂。

Gilbert决定把乳糖操纵子DNA用硫酸二甲酯处理，然后使ONA在腺嘌呤和鸟嘌呤处断裂。为了比较，他把乳糖阻遏子和操纵子相结合，并进行重复试验。和阻遏子起作用的腺嘌呤和鸟嘌呤由于受到硫酸二甲酯的保护，因而DNA不再在那些地方断裂。由乳糖操纵子的DMA顺序是已知的（它被用来复制成RNA，RNA再被测顺序），就有可能知道，在那些地方，阻遏子和DNA相结合。

在完成这些实验以后，Gilbert和他的几位同事们发现了未知顺序的第二个乳糖操纵子。Maxam用这种新的乳糖操纵子经硫酸二甲酯处理后并重复和乳糖阻遏子结合的实验。当他和Gilbert看到实验结果后，他们意识到已经开始掌握一种新的DNA顺序测定方法。利用硫酸二甲酯和控制反应条件，他们能够在腺嘌呤或鸟嘌呤的位置上断裂DNA链。因而，一旦他们能够找到一种方法使DNA在胸腺嘧啶或胞嘧啶处断裂，他们就能够拿到依次递增的DNA片段，这些片段的末端核苷酸便是已知的了。这种想法促使Maxam去寻找使DNA在胸腺嘧啶或胞嘧啶处断裂的方法。他回想到当时采用了适当的化学条件，用肼处理后使得DNA中的某一个核苷酸弱化。经过一个夏天的工作，Maxam成功地完善了DNA顺序的化学测定法。

Sanger和Maxam-Gilbert则用在特定碱基部位裂解DNA的方法获得同样的片段。这二种方法目前都被采用。研究人员在试验了这二种方法以后说，既要依据被测DNA链的长度，也要根据使用者本人的习惯来决定应用何种方法。比如，加州理工学院的Tom Maniatis用Sanger的方法测定极长的DNA链，因为这样速度快。而对于较短的顺序来说，一个或几个基因的长度，则二种方法的快慢差不多。不过Mamatis还是喜欢用Maxam-Gilbent的方法。因为，“Allen已经如此完美地制成了蓝图，所以使用这种方法，人人都可获得成功。”

重组DNA技术和DNA顺序测定的方法的详细情况还不十分清楚。不过这些技术正在改变人们对分子生物学中高等生物基因的认识。

〔Science，1980年210卷〕