直到大约二十五年前,生物学家对于光在植物组织培养的生长和发育中的作用一直很少注意,但近年来,随着组织培养研究特别是在应用方面的研究的发展,研究者们开始认识到光对组织培养物的生长和发育所起的重要作用。

. 光对生长和器官发生的影响

光对植物在细胞、组织、器官水平上的培养均有明显影响。

A. 愈伤组织培养

自从1955年首次报道光可提高愈伤组织生长以来,许多研究者都在试图判明是否不同波长对愈伤组织的生长和发育有不同影响。遗憾的是早期的研究结果是相互矛盾的。例如有人报道蓝光可促进马蹄纹天竺葵愈伤组织的生长,而另一些人却指出蓝光可抑制胡萝卜和爬山虎愈伤组织的生长。更加混乱的是勃格曼(Bergmann)等和维斯(Weis)等认为蓝光可促进菸草愈伤组织生长,而贝欧切斯(Beauchesne)等则认为蓝光抑制其愈伤组织生长,直至1975年赛贝尔特(Seibert)等指出,之所以出现上述情况,是因为研究者使用了蓝光谱区内的不同波长和不同辐照度的缘故,从而解决了矛盾。事实上愈伤组织和芽发生既可能被促进,也可能抑制,这主要取决于照射的光波长和辐照度。

其它波长光也影响愈伤组织生长,例如克莱(Klein)指出,爬山虎冠瘿培养物可被近紫外光( ~ 360 nm)和绿光(550 nm)所抑制。而赛贝尔特等指出菸草愈伤组织生长和芽发生,在照射紫外光(371 nm)高于3.7 W/m,的辐照度时也被抑制。许多研究者指出紫外光和蓝光的抑制作用,可包括IAA氧化酶活性的降低,IAA的光钝化V维生素B12和细胞色素氧化酶的破坏或组织中酚类化合物的增长。

除短波光的影响之外,在一些情况下,长波光也可以影响愈伤组织的生长。红光在不同种植物中的促进作用和抑制作用均已见报道。它在天竺葵中的促进作用是被归之为高能植物光敏素的反应。但由于在远红光谱区中证据不足,上述结果只能被认为是极初步的。另外,红光促进毛状还阳参组织培养物的生长是伴随蛋白质合成和细胞分裂的增加而发生的。激动素可以取代红光对培养在远红光或黑暗中的培养物的影响,但不能取代红光对于照射蓝光的培养物的影响。培养了四年半的毛状还阳参绿色培养组织,只有在照蓝光同时存在赤霉酸时,才能恢复其形成器官的能力。缺叶绿素的愈伤组织,在红光或黑暗中不能形成器官。在菊芋愈伤组织培养中,光的抑制作用可能是细胞分裂降低的结果。有人假设,这是由于665 mn光活化了植物色素调节系统引起一系列反应,消耗了基础代谢产物(可能是苯丙氨酸)使之低于细胞分裂所需的临界水平所造成的。维斯等曾指出将菸草愈伤组织在蓝光下培养两周,然后分别置于黑暗中、红光下或远红光下三周,则比五周时间全部照蓝光的培养物抽芽少,重量轻。说明这些培养组织在整个培养期间需要有蓝光才能发育良好。

1975年有人报道光对从花药诱发的毛地黄再生植物有一种很难理解的影响,即在再生过程中,如果花药被照光,则产生的植物是四倍体,如果花药不照光,则产生的植物是二倍体。

在一般的组织培养光照条件下,愈伤组织可发育叶绿体,进行光合作用,而且产生氧。但当培养基中增加蔗糖时,则培养组织的叶绿素合成和光合作用碳固定受到抑制,致使光合作用产物不能维持愈伤组织的生长和发育。把上述看作光对光形态建成的影响似乎比看作光对光合作用的影响更恰当。

B. 细胞和原生质体培养

在细胞培养中已发现了与愈伤组织培养相似的结果,一些植物的培养细胞,在不同波长的紫外光和可见光的照射下,可能增长或降低其细胞浓度和干物质量。如有人发现红光引起杨属杂种和两种菸草培养物的干重增长,而贝尔格曼(Bergmann)等指出蓝光可引起菸草培养物中质休转化为有光合作用活性的叶绿体。红光和蓝光可影响叶中叶绿体的发育,在暗中生长的叶是不含有质体特性的原片状体。

洛格曼(Logemann)等曾报道光可增加由绿色菸草愈伤组织分离出的单细胞的满皿率相反,光可抑制从无叶绿素愈伤组织分离出的细胞的生长。而毕丁(Binding)指出原生质体培养的满皿效率,生长和发育都是依它们的照光水平而异,太强的光照可能有抑制作用。

C. 器官培养

1. 茎尖培养

直到近年,关于器官培养的需求才有了极少数的资料。一般是将茎尖或侧芽外植体每天照射大约100英尺烛光的冷白荧光16小时,这对于石刁柏、非洲菊、虎耳草属和凤梨属部分植物,已是足够的了。这种光照可以作为寻求器官最佳培养的初始条件。但最好对于每种新的培养植物都使用各种不同类型的宽带光谱荧光灯,进行比较试验,因为不同类型的灯的试验结果可能相似,但它们的价格却相差很远。

另外,狭带光有时也可引起愈伤组织产物和腋芽发生的增长。例如罗林逊(Rolinson)等已证明短时间(16小时)照射低辐照度的红光或较长时间照射远红光,会导致水稻茎尖细胞分裂速度的增长。

2. 子叶和胚培养

1977年卡卡德(Kadkade)等报道的莴苣子叶和黄杉胚的试验结果已证明,红光(660 nm)可以显著影响器官培养中愈伤组织的生长和器官分化。莴苣不定芽的形成是由低能光敏素途径来调节的。在子叶的五周培养期的第二周或者在整个培养期间,每天仅照射(660 nm)光(2.5 W/m2)五分钟,就可以使芽分化数比不照光的对照增长一倍,在黄杉胚培养中不定芽形成也在八周的培养期的中间几周对红光最敏感。

3. 根和根茎培养

光也促进豌豆和菊芋培养的发根。列土兹(Letouze)等证明红光(660 mn)和蓝光可引起菊芋根发生和伸长。在莴苣子叶培养中,也已观察到了红光促进根发生。他们观察到红光促进菜豆苗的根发生。显然这是一种与光敏素有关的缘故。

此外,庞特指出,红光也导致野生旋花培养根段中内生芽的伸长,而这过程也是被光敏素所调节的。

4. 叶培养

莱格朗(Legrand)W72年指出,在菊苣的培养中,为最大限度形成不定芽,最初需要置于黑暗中或照射日光灯(150英尺烛光),芽形成的数量是与最初照光期成比例的。连续光照甚至可使在黑暗对照中观察到的反应提高一倍。

上述结果表明光强度,光波性质和每日照光长度对细胞和组织培养的生长及器官发生均有深刻影响。

. 光对植物产物的影响

光除了影响离体植物生长和发育以外,也影响植物代谢产物。

A. 原初产物

1.

从植物细胞培养中已得到许多有关光影响次生代谢酶反应的资料。同时许多参与某些次生产物如肉桂酸、香豆素、木质素、黄酮、黄烷醇、苯基乙烯酮、花色素苷等代谢途径的酶,已被鉴定出来。

光对类黄烷代谢途径的所有酶都有影响。参与皱叶欧芹类黄烷合成的酶,可根据其作用方式,分为两个不同的类。第一类包括L - 苯丙氨酸解氨酶(PAL),肉桂酸4 - 羟化酶和P - 香豆酸盐:COA连接酶。第二类有黄酮合成酶,葡萄糖转移酶,芹糖转移酶,UDP - 芹糖合成酶,苯基苯乙烯酮黄酮异构酶和其它酶。第一类酶催化苯丙烷衍生物的形成,而第二类酶专门参与黄酮糖苷的合成。第一类和第二类所有的酶活性,可分别在照光2和4小时之后被提高。哈尔伯洛克(Hahlbrock)等指出这些酶的大多数,在欧芹细胞黑暗生长(10天)时活性最低,肉桂酸4 - 羟化酶和P - 香豆酸盐:COA连接酶的活性仅有在光下生长材料的30 ~ 40%。而在欧芹细胞得到连续光照时,第一类酶在15 ~ 23小时后活性最高,而第二类酶则在24 ~ 37小时后活性最高。他们还指出参与苯丙烷类合成的酶的调节机制与黄酮生物合成的调节机制是不同的。这种观点已经为使用转录和翻译抑制剂的试验所证明。将这些抑制剂在照光前加入欧芹培养细胞,与未加抑制剂的培养物相比,PAL活性的增高受到百分之百的抑制。在这种情况下,所有其他的第一类酶,和苯基苯乙烯酮、黄酮异构酶的活性,也都比未处理的培养物低得多。而第二类中其余的酶活性在加入这些抑制剂时不受影响。一般认为,pal活性的光诱导增加,是由于酶的重新合成,而不是由于酶前体(即酶的钝化形式)的活化作用。另外,PAL活性会受到在照光后不同时间加到皱叶欧芹培养细胞中的抑制剂的强烈影响。放线菌素D对PAL活性的抑制作用随时间而线性地降低,环已亚铵的影响则在整个滞后期中保持不变,然后下降。这些结果表明,在pal重新合成期间需要RNA和蛋白质的合成。

在确定活性光谱区时,格利高(Gregor)等人都指出蓝光可增高纤细单冠菊愈伤组织和培养细胞的PAL活性及随之产生的花色素苷的量。最敏感的时期是继代培养后三星期,随后再照光48小时,PAL活性可能提高为400%,接着逐渐下降。如果单照红光或远红光或者在红光、远红光诱导后再照蓝光,都不影响PAL活性。

2. 碳水化合物

托帕(Thorpe)等1972年研究了菸草愈伤组织的淀粉代谢,他们发现每天照光16小时(270 fc)的培养物中淀粉积累比黑暗培养出现得更早。而且在光培养中,淀粉的最高积累与组织分化的出现是一致的。

3. 类脂

生长在光自养条件下的红藜细胞悬浮培养物可产生相当多的在光合成组织中存在的典型类脂,如单半乳糖基双酰甘油、双半乳糖基双酰甘油、甘油磷酸甘油脂和一些硫代异鼠李糖基双酰甘油等。而在异养培养中前二种类脂最多含1 ~ 2%,后二者仅含微量。在光自养培养中,红藜细胞培养物的类脂的脂肪酸型也类似于红藜绿叶中的脂肪酸型,亚麻酸约占了光自养培养中全部脂肪酸的30%。而在异养培养中它只占15%。

4. 氨基酸

克利考利安(Krikorian)等提出光可以影响细胞悬浮培养中氨基酸的浓度和组成。在花生细胞,光处理可增强谷氨酰胺的生成,暗处理则可引起天冬酰胺的积累。有人认为在蚕豆(vicla faba)和一种黧豆属植物中,3.4——二羟基丙氨酸(L - 多巴)是受光和激素影响的,尽管连续光照(冷白荧光灯)增加培养细胞的生长,但它却减少细胞和培养基中L - 多巴的积累。L - 多巴水平在黑暗生长的悬浮细胞中较高,而在大多数是积累在培养基中。在发痒黧豆苗的固体培养中也已看到相似的结果。

B. 次生产物

1. 黄酮和黄烷醇

有两位科学家曾报道,当皱叶欧芹长时间保持在黑暗中时,它们可以增殖,但不产生类黄烷,一旦它们被照光则糖苷、芹菜苷的含量均会提高。当培养物生长在连续冷白荧光灯下时,黄酮和黄烷醇糖苷会高出20多倍。

黄酮糖苷合成对320 nm以下的紫外光最敏感,单用红光是无效的。但在预照紫外光后照红光也会影响黄酮糖苷合成,这涉及到红光、远红光、光敏素系统。维尔曼(Wellmann)认为可能光敏素在照紫外光后,由钝化形式变成了活化形式。

2. 花色素苷

许多研究结果已表明一些植物的愈伤组织和细胞悬浮培养物中,花色素苷合成受到光激发。有人报道了蓝光刺激纤细单冠菊愈伤组织中花色素苷合成,而红光无效。

阿尔非曼(Alfermann)等还证明胡萝卜细胞培养中花色素苷生物合成要求生长素和光,但光诱导作用与生长素诱导作用是完全不同的。花色素苷在照光3天后,即可测出,而加生长素的效果要在6天后才能测出。环己亚胺和2 - 硫脲嘧啶抑制生长素诱导花色素苷的形成,却促进光培养下的花色素苷的合成。这些结果表明,控制胡萝卜细胞培养中花色素苷积累的,至少有两种不同的机制。赤霉酸既抑制纤细单冠菊和胡萝卜细胞培养的光诱导的花色素苷产生,又抑制生长素诱导的花色素苷形成。另外,花色素苷合成量决定于照光时的纤细单冠菊发育阶段。培养物照光前置于暗处3天者,比仅一天暗处理者花色素苷积累更多。

3. 萘醌和多酚

冷白荧光灯(530 fc)抑制紫草愈伤组织的萘醌生物合成。比较各单色光的作用,说明抑制是由蓝光引起的,而与红光和绿光无甚关系。特倍德(Tabate)等指出蓝光可能抑制其前体的形成,或者抑制关系到它的合成的中间体的转变。

福日斯特(Forrest)证明在植物组织培养中,光可刺激多酚合成。在照光条件下,普洱茶愈伤组织中儿茶酸,表儿茶酸和无色花色素浓度成倍增加。Davis报道,保罗红玫瑰细胞悬浮培养中,多酚合成速度,是受培养基中生长素浓度和照光强度的影响。高光强度可以部分地逆转5×10-5M2.4-D对多酚合成的抑制及5×10-7M2.4-D对多酚积累的刺激。

4. 挥发油和萜

在芸香茎组织培养中,挥发油的合成和成分依光强和光质而异。生长在连续冷白光(250 fc)下,愈伤组织中的挥发油组成与绿色植物相似,主要成分

是十一烷酮,醋酸十一烷脂,十一烷醇、次要成分是壬酮,醋酸壬脂,壬醇,还有微量的佳节烯和前佳节烯。同时光还刺激特殊的油通道形成。

生长在连续红光或远红光下的细胞与暗中生长细胞产生的主要油成分相同,生长在蓝光下的培养物与每天照冷白荧光灯15-20小时的培养物产生的油成分相似。

[Plant Tissue Culture as a Source of Biochemicals 1981年版第123—141页]