高等植物纲间杂交的探索

发布时间：86年01月25日

朱培坤

[编者按]关于高等植物的远缘杂交，一般来说很难突破科的界限。本文作者（复旦大学生物系助教）在近几年里用他首创的“植物外源遗传物质动态导入法”，在高等植物目之间、亚纲之间、纲之间进行了“超远缘杂交”的试验，并且获得了完整的植株。这些成果陆续在多份学术期刊上发表。高等植物超远缘杂交的研究对于简便快速、大量丰富植物基因库，人工创造植物新品种、新物种，具有重要的价值。另外作者对无性杂交、无性杂种等科学概念提出了新的见解。本刊特邀作者就高等植物超远缘杂交的工作作一综述，以期引起各界人士的关注。

众所周知，鸟类和哺乳类动物均属于脊椎动物亚门，但它们属于不同的纲，相互之间能杂交吗？能使鸟儿长出虎斑，虎儿披上羽毛吗？目前暂时还不能。但是对于植物来说，情况就不一样了。不久前，笔者已成功地使被子植物亚门单子叶植物纲的胡葱、大蒜与玉米分别和双子叶植物纲的青菜进行无性杂交，获得了单子叶植物纲与双子叶植物纲杂交的完整植株。植物纲间杂交的成功，是生物工程发展的必然结果。

农业科学中改良植物品种一向受到人们重视，成功的事例比比皆是。但是，由于植物亲缘关系的局限和杂交手段的欠缺，因此在进行植物远缘杂交时，很难超越科的界限，成功的报道几乎多是种间、属间的杂交。长期以来，植物杂交的技术基本上是二项，即有性杂交与嫁接。有性杂交如在种内进行，成功的可能性较大。但是如在种外进行，成功的可能性随着种属差距增大而减小，常常发生风马牛不相及的事。某些有性杂交的研究工作者认为，植物的柱头与花粉，具有一套识别蛋白的系统，这种识别信号仅仅在“自己人”之间适用，一旦不是“自己人”，授精就不可能。在分类学科中，认为“种”是“具有一定的形态和生理特征以及一定的自然分布区的生物类群”。生物个体在种内可以自由交配，而与种外的生物体，在自然状态下，一般不会与之发生交配，或者虽能交配，但所得后代不育。因此，“种”的概念，对于杂交来说，是天然排斥的。偌大的世界，昆虫亿万，穿越在花丛中的蜂蝶万千，尽管它们忙忙碌碌，但是，它们使不同种植物发生有性杂交的可能性是很小的。在大自然界里，每种植物还是按它自己的面貌生长与繁殖，虽有少数突变发生，产生变异，但是在正常情况下，物种是稳定的。

除了有性杂交外，嫁接也是被不少人用来改良植物品种的手段。早在几千年前中国、埃及、印度等文明古国，均在农业生产中采用过嫁接技术。我国有许多古书，例如唐代《种树学》、宋代《桔录》、元代《四时类要》，明代《本草纲目》和清代《花镜》等，均有嫁接的一些记载。诞生在十九世纪的俄国园艺学家米丘林，运用嫁接技术，培育出许多果树新品种。但是嫁接的机学复杂，成功带有偶然性。在现代道传学发展的时代，本来应该对嫁接的机理进行深入研究探讨，从而使又类正确认识嫁接的本质与作用，但是，由于众所周知的原因，米丘林的园艺成果，与某些政治因素结合起来，某些人依靠政治力量推行一种学术观点，对不同学术观点的学者进行政治迫害，即使米丘林的园艺成果没有被正确解释与认识，又使植物远缘杂交的研究误入歧途。在那时，嫁接与政治上的个人迷信一样，被抹上了神话的色彩。回首往事令人痛心。但是痛心之余，尚需正确认识嫁接，因为在科学上不能搞以其人之道还其人之身。不能因为李森科被批判而将植物嫁接也予以否定。我们应该将脏水倒掉而留下婴孩。无数事例证明，嫁接对植物性状的改良确有不同程度的作用。这几年，上海市崇明县农民龚祖臣，运用嫁接技术对桃树的改良取得较大的收获。与有性杂交相比，嫁接较能克服不同种属不亲和的现象。但是嫁接亲和力是有限的，因此要想采用嫁接使单子叶植物与双子叶植物进行杂交，这是不可能的。如果我们将白菜作为砧木，大葱作为接穗，大葱嫁接于白菜，不消几天接穗泛黄从而死亡。大葱与白菜分属不同的纲，亲缘关系相距很远，相互之间的排异性很大。另外，嫁接重视接穗与砧木形成层的愈合，单子叶植物与双子叶植物不同，它没有形成层，因此谈不上形成层的愈合。所以采用传统的嫁接技术，是无法实现植物纲间杂交的。

除了上述提及的有性杂交与嫁接技术外，在改良植物的遗传性状时，近几十年中，也采用诱变育种技术。对植物的种子，施以适当的物理因素或化学因素，使其遗传基因改变原有的排列，从而发生生物性状的突变，最终筛选获得具有明显经济性状的新个体，这是近几十年来发展的较为先进的育种技术。但细胞遗传基因排列的改变，不等于导入了其它植物的遗传基因，即不等于能实现单子叶植物与双子叶植物的杂交。

1972年，卡尔松宣布用细胞融合的方法已经获得烟草的种间杂种。所融合的材料是绿色烟草与郎氏烟草。郎氏烟草叶片无柄但披盖密毛，染色体是2n=18；绿色烟草叶片有柄但光滑无毛，染色体是2n=24。通过细胞融合和愈伤组织培养获得的杂种具有俩亲本的性状，染色体是2 n=42。这是人类历史上，通过体细胞融合第一次获得的植物远缘杂种。在以后几年里，人们对细胞融合改良植物遗传性状寄予很大的希望，并且继烟草属的工作又在矮牵牛属里获得了细胞融合的杂种。许多科学家对细胞融合的工作发生兴趣，甚至使麦子与老鼠的细胞也发生了融合。当然，不用担心，麦子没有长出鼠毛。虽然麦子与老鼠的细胞可以融合，但是融合的时间非常短暂，更谈不上融合细胞的分化和发育。在这儿不同种属的细胞排异性又一次使人类进行目间、纲间、门间甚至界间细胞融合远缘杂交的希望遭到了打击。迄今为止，通过体细胞融合获得杂种的事例的确不多，并且还没见到属间以上细胞融合获得杂种的报道。

本世纪七十年代在微生物领域中兴起的基因工程，使许多人对在高等植物之间进行超远缘杂交产生了希望。可能还没有人使用过超远缘杂交的字眼，那么什么叫超远缘杂交呢？笔者将纲间（包括纲）以上的生物杂交称为超远缘杂交，这一提法是否妥当可以讨论。在1978年与1980年，美国科学家相继宣布将人工合成的人胰岛素基因与人干扰素基因分别转移到大肠杆菌细胞中，并且分别产生了胰岛素和干扰素。那么将单子叶植物基因转移到双子叶植物细胞中，通过基因杂交，产生具有单子叶植物某些性状的双子叶植物，应该更不在话下了，然而，事情并不是如想象的那样合人心意。基因工程的方法目前在原核生物或最简单的真核生物中虽然效果良好，可是在高等真核生物中，有许多困难。真核生物细胞库存的遗传信息量浩大，从真核生物细胞中钓出一个目标基因，并非易事。另外，在真核生物遗传工程的研究中，选用合适的能自主复制的载体，也要投入大量的研究。如果目标基因与载体解决后，转入高等真核生物的细胞中后，是否能顺利整合到受体细胞的DNA中去，也是一个问题。就是能整合进去，还有一个表达问题。最后，需要将该细胞培养成个体。特别令人伤脑筋的是高等植物的大多数性状是由多基因决定的。并且这些决定某一性状的基因不是相互并排排列的，而是立体空间分布的。显然，通过目前在微生物领域使用的基因工程的方法，使双子叶植物表达单子叶植物的某些性状谈何容易。英国育种家斯毛兹认为，植物的各种性状是由多个基因控制的，并且体细胞杂种往往是细胞质变异，很不稳定。因此植物基因工程是梦想。当然，在植物育种中，取消基因工程，大可不必。那么，目前在高等植物中怎样逐步实现通过导入外源多基因从而表达新遗传性状的工程呢？这个问题，无论是理论上还是实践上，对于实现植物的纲间杂交，均是十分重要的。我们在今年二月号的上海《自然》杂志上曾提出“多基因工程”的见解，认为在眼前，切实可行的途径，不妨先将自然存在的多基因不采用载体直接导入植物细胞中去，然后采取适当措施，使受体细胞分化成完整植株。植物纲间杂交的成功，从理论上讲，与多基因工程的见解紧密相关。

另外，在理论上还要对无柱杂交的概念，进行探讨。这些探讨，与高等植物的纲间杂交也是密切相关的。传统的“无性杂交”概念在我国1978年出版的《辞海》（生物分册）中是这样认为的：“亦称‘营养杂交’。通过营养器官的接合，使不同个体交换营养物质以产生杂种的一种方法。植物方面通常采用嫁接的方式，使砧木同接穗相互影响而产生杂种；动物方面有人曾采用移植卵巢或受精卵交换蛋白或输血等方式。用无性杂交方法产生的杂种，称为‘无性杂种’。”如果受传统的“无性杂交”概念的束缚，不可能实现单子叶植物与双子叶植物之间的杂交。胡葱、大蒜等与青菜的营养器官能接合吗？笔者试验过，接合不了，作为接穗的胡葱或大蒜很快会泛黄和衰亡。另外，“交换营养物质”产生杂种，是违背同一本《辞海》中所宣布的原则的：“现代分子遗传学的研究表明，基因是具有特定的核苷酸顺序的核酸（主要为脱氧核糖核酸）区段，是储存特定遗传信息的功能单位，但一基因内部可发生不同位置的突变和交换。”依据这一原则，很清楚是基因决定性状。产生杂种的前提是基因杂交，而不是“交换营养物质”，只有当单子叶植物的遗传物质导入双子叶植物细胞后发生基因杂交，才有可能获得单子叶植物与双子叶植物纲间杂交的植物。关于现代无性杂交的概念，笔者认为应是：外源遗传物质采用非有性杂交的方法导入受体细胞后，与该细胞原有的DNA发生分子杂交，产生表达有关遗传信息和性状的杂种的方法，称为无性杂交。另外，应当指出，如果将含有大量DMA的染色体或特定的具有基因属性的细胞器导入受体细胞，产生具有有关遗传信息和性状的杂种的方法，也应称为无性杂交。在上述无性杂交方法下产生的杂种就是无性杂种。我们每个人均耳闻目睹嫁接改造植物的事实，但是，关于嫁接的本质必须澄清，发生杂交的原因，不是营养物质的交换，而是遗传物质的交流，由于遗传物质的交流，才有可能发生基因杂交，才有可能产生无性杂种。这一点，笔者曾在去年3月份在本刊提出过讨论。有些人只从表面现象上看，嫁接似乎是植物营养器官的接合。但是组成植物有生命活力的营养器官是体细胞，在每个细胞中均含有遗传物质。嫁接虽然也会造成营养物质的交换，但杂交的本质是外源基因与细胞内基因的分子杂交。

那么，在植物嫁接后，是否有可能交流遗传物质呢？笔者认为这是不言而喻的。国内外许多学者，在许多种植物中观察到染色质、染色体、叶绿体、线粒体甚至细胞核的穿壁运动。它们从一个细胞通过胞间连丝穿壁进入另一个细胞。另外，有的学者甚至认为，筛管运输是以原生质转移与汁液集体流动的双重方式来进行的。大量文献指出，植物细胞的穿壁运动是较为普遍的现象。我们结合自己的工作进行进一步分析，在今年出版的《上海农业学报》创刊号上指出，植物嫁接后，由于机械损伤，有可能促使发生对自己生存遇到危险的生命物质（包括遗传物质及其结构）纷纷向其它细胞内“逃命”的现象。另外，从物理学上压强与流速的关系看，由于嫁接切口对细胞的机械损伤，也能促使破损细胞内的原生质进入完好细胞内去。事实上，通过嫁接能实现一种植物的遗传物质或其特定结构向另一种植物的细胞内转移。在这个问题上，不能进行曲解，所谓“人吃了猪肉就变成猪锣”的讲法对认识嫁接的科学本质是无益的。在遗传学的历史上，嫁接虽然是一个古老的字眼，但是却是一个非常敏感的字眼。近代遗传学历史上重要的争论，与嫁接均有不同程度的关系。传统的无性杂交观点，将嫁接看作植物方面通常采用的使不同个体交换营养物质而产生杂种的方式。可见在传统的植物无性杂交观点中，嫁接的本质被完全误解。从“交换营养物质产生杂种”的错误观点出发，当然不可能通过嫁接实现高等植物的纲间杂交。曾遭受所谓“米丘林学派”迫害的一些学者，他们对传统无性杂交观点的反对是正确的，但是他们对传统无性杂交观点的反感却牵连到嫁接，以致他们不少人对嫁接也产生了反感，否定通过嫁接能改良植物品种的事实。其实用基因学说去分析和认识嫁接的作用，才能彻底否定传统的无性杂交观点，从而使古老的嫁接得到正确解释与发展。笔者通过植物外源遗传物质动态导入法，实现高等植物的纲间杂交没有什么秘密，无非在理论上接受现代分子遗传学的观点，特别是在多基因工程与植物无性杂交方面希望创新；在实践上承认并重视植物嫁接能改良植物品种的客观巿实与悠久历史。在植物的不同生命现象中，研究其可能存在的联系，并且试图将这些联系用于实验的构思中，从而终于获得了纲间杂交的完整植物。显然，动态导入法绝对不是近代遗传学历史上两大对立观点的调和，而是试图将两大对立“学派”的正确方面予以综合的结果。我们承认嫁接的作用，但是我们对无性杂交与无性杂种，赋予新的涵义。

我们获得的纲间杂交植物与德国植物学家温克列尔所提出的“嫁接嵌合体”截然不同。温克列尔将番茄作为接穗，嫁接在砧木龙葵上，嫁接成活后，他将番茄在嫁接愈合处切去，由愈合处愈伤组织分化的芽具有番茄与龙葵的组织。在我们的实验中，是将双子叶植物的体细胞作为受体细胞，而将单子叶植物作为供体，使单子叶植物的遗传物质导入受体细胞中去。另外子叶植物与双子叶植物的组织是无法嵌合在一起的，这一点是显而易见的。目前，在笔者手中，外源遗传物质的导入是随机的，并且作为受体细胞并不是单个的，每个细胞接受外源遗传物质是不均等的。但是绝对不是供体植物细胞组织与受体植物细胞组织共同嵌合成为嵌合体。

另外，在高等植物纲间杂交的探索中，笔者十分重视受体细胞的性质。国内外许多科研人员对目标基因与载体的研究十分重视，并且做了大量有益的工作，但是，对受体细胞的研究却忽视了。其实重视受体细胞的研究，是事半功倍的重要因素。我们在发表的一些论文中曾多次指出，分生细胞作为受体细胞的优越性。因为分生细胞不但是薄壁细胞而且处于原质体状态，一方面大量需要“组装材料”以便分化，另一方面表现出可塑性大的特点。这些性质使得外源遗传物质既容易导人分生细胞，又容易整合进入分生细胞的DNA中去，从而又容易分化成完整个体迅速表达有关性状。笔者获得胡葱 - 青菜、大蒜 - 青菜和玉米 - 青菜的完整植株仅需2 ~ 3个星期而已。

近三年以来，我们采用动态导入法，分别获得了青菜 - 甘蓝种间杂种及其Pi代，叶用甜菜 - 甘蓝目间杂种及其A代，青菜 - 马兰亚纲间杂种，胡葱 - 青菜纲间杂种，大蒜 - 青菜纲间杂种和玉米 - 青菜纲间杂种等无性杂交的植物。这些新类型植物均采用有关的实验技术进行过验证。验证杂种的传统方法往往是染色体观察和杂种后代不育性测定。杂种的染色体一般发生各种情况的变化，通过对染色体数目或带型的分析，有助于杂种的鉴定。另外，植物远缘杂种后代往往有不育或几乎不育、至少部分不育的现象。但是无论是染色体观察或者是后代不育性测定，均不够权威，还要辅以其它指标。因此采用更权威性的验证方法确定杂交过程已经完成，是非常重要的。在七十年代人们终于发现分子量约为55万道尔顿的组分Ⅰ蛋白（亦称为RuBP羧化酶），可以用作核基因和细胞质基因的表型标记。许多著名的从事体细胞杂交的科学家，将组分Ⅰ蛋白的电泳特性用于鉴定早期杂交过程是否完成的权威指标。组分Ⅰ蛋白是由多基因调控编码的，它的8个大亚基由叶绿体DNA编码，并在叶绿体内合成；它的8个小亚基由核DNA编码，在细胞质中合成。每种植物的组分Ⅰ蛋白在其结构上具有特异性，并且这种特异性只要有关DNA不发生变化，就稳定地存在着，不受环境、生理等因素的影响。因此，采用动态导入法，如确能将外源基因导入受体细胞并发生整合与表达，应该在组分Ⅰ蛋白的特性上反映出来；反之、如果杂种的组分Ⅰ蛋白的结构发生变化，也就说明杂交过程确已发生。但是应该注意的是，有时候杂交虽然发生，但是恰恰不涉及有关组分Ⅰ蛋白的DNA，也是可能的。在应用组分Ⅰ蛋白的电泳特性进行鉴定杂种的过程中，我们将凝胶等电聚焦电泳改变成交叉免疫电泳，使方法更简便，如使用全酶抗体，虽然不能分析大、小亚基变化，但确定杂交完成的结论同样具有说服力。采用权威的简便的杂种鉴定方法，是宣布获得远缘或超远缘杂种的前提。否则获得了杂种也会产生许多令人生畏的问题。我们对青菜 - 甘蓝当代和F₁代植株，对青菜 - 马兰植株，对胡葱 · · 青菜、大蒜 - 青菜及玉米 - 青菜的组分Ⅰ蛋白所进行的交叉免疫电泳分析，结果良好。对胡葱 - 青菜和大蒜 - 青菜还成功地进行组分Ⅰ蛋白大、小亚基的交叉免疫电泳分析，在分子水平上，验证了单子叶植物（例如胡葱、大蒜）的有关基因确已导入双子叶植物（例如青菜）的体细胞，外源基因与受体细胞DNA发生了分子杂交，并且表达了某些遗传信息，使双子叶植物出现了单子叶植物的某些性状。在青菜 - 甘蓝的组合中，通过组分Ⅰ蛋白的交叉免疫电泳鉴定，证实导入的有关外源基因在F₁代继续表达。

科学的发展经常与人类捉迷藏。常常发生故意栽花花不活、无意插柳柳成林的事实。虽然我们已经成功地将单子叶植物的遗传物质导入双子叶植物，并且获得了能表达有关外源基因的完整植株，但是在以前，我们自己也不敢想象能够成功。在前几年，笔者还认为纲间杂交是一个神话。现在事实证明，在高等真核生物至少在高等植物的遗传工程中，只要采用适当的方法，选用合适的受体细胞，是能将外源多基因导入受体细胞进行分子杂交，从而能够使外源DNA整合与表达，获得具有新遗传信息与性状的个体的。在分子生物学的时代，对那些古老的技术与成果，仍应加以重视。因为在这些平凡的事实之中，却蕴藏着深刻的道理，人们并没有完全认识与掌握。一旦用分子生物学的知识去认识古老的技术与成果，有可能获得重要的进展，从而促进分子生物学与生物工程本身的发展。

高等植物超远缘的杂交，刚刚开始。动态导入法的提出，不过是研究高等植物超远缘杂交的一个起点。我们曾将λ DNA酶切后导入甘蓝体细胞，获得过能表达λ蛋白质的甘蓝植株。可惜在几个月后，当再用对流免疫电泳去检测时，却没有测出λ蛋白质。这是很有意思的，值得令人进一步探索。英国《新科学家》杂志曾用“牛肉西红柿”向公众开了一个大玩笑。但是，如果将牛的DNA片段导入蔬菜的体细胞后由此获得的植物，有可能表达牛蛋白质，那时候，人类不是可以食用“牛肉蔬菜”了吗？这不是胡思乱想，而是有可能在不久实现的事。我们应该努力！

远缘杂交的植物有一个共同的问题，即杂种稳定性。当然如果能杂交成功，那么在当代也是能获得某些经济效益的。但是要获得稳定的植物人工新品种或新物种，必须在稳定性上进行研究与探讨。值得考虑的方法有许多，例如杂种花粉培养或单细胞培养，然后染色体加倍；或者让其自然分离几代，直至稳定为止，等等。不能因为需要研究稳定性而否定外源基因导入与表达的重要性，因为只有实现了导入与表达，才有可能讨论稳定性问题。有些人可能会问，动态导入法究竟导入什么遗传物质？我们现在对受体细胞导入的遗传物质还没纯化，但是，从核基因和细胞质基因的表型标记 - 组分Ⅰ蛋白的分析，清楚地表明有关基因已经导入实体细胞并且发生了分子杂交，在此基础上得以表达，从而获得具有中间形状的组分Ⅰ蛋白交叉免疫电泳图形。进一步的工作，应该将纯化的DNA甚至将目标基因导入受体细胞，逐步实现定向改造植物的目标。但是，在一项新技术刚出现之际，希望各界人士能予以关怀和帮助。在目前，我们不能因为不清楚植物有性杂交时，花药花粉的什么基因进入子房卵细胞发生杂交，而否定有性杂交。

高等植物纲间杂交的成功，对被子植物亚纲间、目间与科间远缘杂交显示了“绿灯”，同时，生物门间、界间超远缘杂交也产生了现实的希望，从而有可能大大丰高植物的基因库。动态导入法一旦被人们掌握预计可以变成生产力。另外，由于高等植物纲间杂交的成功，是通过向受体细胞导入外源遗传物质而获得的，因此对真核生物的遗传工程将产生有益的影响。

在研究与探索过程中，笔者分别得到本校副校长华中一教授，科研处处长沙麟教授、校植物病毒研究室主任王鸣歧先生，植物遗传研究室主任蔡以欣先生，生物化学教研室主任孙崇荣先生，植物教研室主任倪德祥先生，上海自然博物馆植物馆馆长、复旦大学教授徐炳声先生以及复旦大学生物化学教授沈仁权先生等许多学者的指教与帮助，特此致谢。

参考文献

[1] 朱培坤，《世界科学》，1984，3，14 ~ 16。

[2] 朱培坤、蔡以欣，《自然》杂志，1985，8（2），118 ~ 126。

[3] 朱培坤、王鸣歧等，《上海农业学报》1985，1（1），43 ~ 50。

[4] 朱培坤，《自然》杂志，1985，8（32）。

[5]《辞海》（修订本）生物分册，上海辞书出版社，上海，1978，43-50。

[6] 郑国铝，《细胞生物学》，高等教育出版社，北京，1980，107 ~ 111。

[7] 娄成后等，《植物学报》，1973，15（2），204-220。

[8] 柴常星等，《遗传》，1985，7（4），5 ~ 8。

[9] Maheshwari S. C. et al. ，Sci. Progress. Oxf. 1980，66，435。

[10] Uchimiya，H. et al，Plant Sci Lett. ，1979，14，387。

[11] Melchers，G. et al. ，Carlsberg Res. Comm. 1978，43，203 ~ 218。