几十年来,植物种间的基因转移,在作物改良中发挥了巨大的作用。已把某些野生植物所具有的诸如抗病虫害和抗倒伏等有用特性转化到了栽培作物中;重组DNA技术大大扩大着益于作物改良的遗传信息;基于重组DNA的基因转化系统,对于几种作物的改良是很有效的,并正在研究用于其他作物种;配合应用传统的和最新的基因操作技术,将会更有助于作物改良。

在利用重组DNA技术,研究操作植物基因信息的手段方面进展迅速。业已克隆了植物基因;破译了遗传调节信号;把能提供农业有用特性的基因从完全无关的微生物(尤其细菌和病毒)中转移到了栽培作物内。

我们在本文中选择列举了植物育种人员长期在植物种属间所进行的基因转移的实例;介绍基因重组DNA的植物基因转移,并指出所列举的例子对进一步进厂作物改良有用。分析指出,技术的发展已扩大了可提供能在植物中安家落户遗传信息的微生物的范围(图1),并强调了继续发展这些技术的重要性,结论关系到作物改良中的技术应用和进一步加强农业。

1.2.1

通过杂交的基因转移

植物育种和种内基因转移   植物育种作为一门科学,是在十九世纪随着对植物性状遗传方式的发现而兴起的,早期发现了在栽培的各种植物内,出现大量基因转移和重排现象。育种人员把对新的遗传变化的研究逐渐扩大到了包括野生植物在内的所有作物。这些都是种内的基因转移。现在栽培的所有作物,都是起源于最初的杂交种。可是,作物种内往往并不出现充分益于改良的遗传变异,这就迫使育种人员采用新技术,研究提高变异的方法。

简单地讲,植物育种就是在两个亲本经杂交基因改变之后,选出获得了有用特性的植物,当把相近的野生种和栽培种进行杂交时,就可得到改良了的变种,选出有用的重组特性。统计学方法的应用,使植物育种—跃成了一门尖端科学。结合遗传概率理论,已使植物育种学家们获得了在群体和种系内选择和重组基因的更有效模式。现在,在实验田的设计及其结果的预测和分析等方面,都离不开统计学方法了。

种的界限是由遗传分离的概念确定的。但是,种间的性基因交换,可以不经人为的干涉而自然出现。玉米和野生玉米之间的杂交,是这类基因转移的最好例证之一。在过去的80年间,植物育种人员通过利用由性机理而发现的回避遗传交换中的自然障碍物的有效方法,把种之间的性基因交换作为遗传变异的基础,使作物改良成为可能。

种间基因转移   进入二十世纪以来,植物育种人员不断在一定作物中,采用种间杂交技术,转化野生植物的基因到相近的栽培种内(表1)。本世纪内小麦育种的实践足可以说明这种进展情况。1930年,麦克凡登(McFadden)把4倍体双粒小麦的抗茎锈和抗黑粉病基因转化到了6倍体小麦中,得到的小麦变种,在美国广泛种植,保证了美国小麦栽培史上的最长的无锈病期。其他抗茎锈、白粉病以及抗小麦瘿蚊基因,也分别从提莫菲维小麦、单粒麦和肿胀小麦中转移进了各种小麦种内。

通过种间杂交转化基因的另一种作物是番茄,早在1936年,塔克(Tucker)等人就把一种无用茴芹叶番茄的抗镰刀菌枯萎病基因转移到了栽培番茄中,因该病当时在世界范围内出现,所以由茴芹叶番茄提供的抗病基因,在全世界的商品番茄生产中都起到了关键性作用。栽培大豆和相近的多年生野生种之间的成功杂交,是应用种间基因转移的较新例子。

属间的基因转移   成功转化同一属内的野生种的基因到相近的栽培种内,开了扩大到属间杂交的先例。对我们现有作物种的不断加强认识,这是重要线索之一。现在的所有作物,如芸薹、烟草和小麦,都是起源于不同种属间的杂交。芸苔的祖先,是甘蓝和野生芸苔的杂交种。如今,已模拟了创造新作物方式,由黑麦属和小麦属的杂交,培育出小麦新品种。

不同属中的种间的有意杂交,已成功转化了有用特性(表1)。小麦育种的成功是很好的说明。利用山羊草、冰草和黑麦属中的野生种和栽培小麦杂交,把包括耐盐性和抗病性在内的各种有用特性转化到了栽培种内。属间的基因转移,如今还在发展中。

1.2.2

生产杂交种的方法   自然障碍物的存在,给种属间杂交种的获得带来困难。利用这些方法成功转移的基因,都是利用了两个种的花粉,由受精作用开始。两个种形成的配子,经连续的细胞分裂形成胚胎,经发育和胚乳共同构成成熟种子,由种子发芽长成新植物,产生的复合染色体必须是稳定的,否则杂种不育。在生产杂种植物过程中的许多步骤中的任何一步中失败,都会造成杂交种的死亡和不育。

种间杂交即使产生出了活的合子,由于不一致基因之间的相互作用,也会阻碍胚的正常发育。因此胚不能活下去,三十年代,开始应用组织培养技术对分离的胚进行培养。供杂种胚生长的物质,一般选用重要组织,胚发育早期阶段的胚乳和发芽期间的子叶。在培养过程中,保护胚不让其死亡是关键问题。

能在玻璃管内培养的非成熟胚,一般都有可见的分化信号。用植物激素处理胚珠或种子,可促进处于不一致胚珠阶段的胚胎发育至能在玻璃管内培养。如用红霉素处理带有小麦 - 大麦杂交种胚的麦粒,能使胚活10天,其间可将它移出培养,当充分分化时,再转移到合适培养基中培养。

成功得到一个杂交植物之后,因亲本染色体在相容性和数量方面存在的差别,还可引起不育。原因是在细胞分裂期间、染色体的配对不完全或不稳定,可用有分裂抑制剂——秋水仙碱促进亲本单方或双方的染色体复制。还可把得到的杂交种回交到栽培母本中,并对选出的具有供体种染色体的后代进行细胞遗传学监测。进一步操作,便可产生出具有非作物染色体对的稳定系。这些染色体对或者是取代,或者是加入进了作物染色体对内。

有用基因以供体组合到作物染色体内,必定发生重织。如果两个种很接近的话,可以出现自然配对和重组。照射处理,可诱导供体染色体片段在寄主染色体中的易位,固定供体片段所带的有用基因。

发展有用的作物变种   通过性的方法,种属间的基因转移即便成功的话,也是费时费力的,更何况要得到一个有用的表型,还必须解决其他问题。在种内基因转移中,经6次回交之后,仍不能使相近的基因分离。也就是说,对作物质量、产量和适应性不利的特性,也会混杂在有用特性中。有害基因分离上的困难,限制了通过杂交获得有用变种的商业潜力。即使分离到了有用基因,那么在新遗传环境下,它的遗传和表达也可发生难以预料的变化。

无性基因转移法

研究无性基因转移法,已使在玻璃管内对植物细胞、器官和组织进行培养成为可能。有性基因操作成功的关键,在于救活胚;而许多无性基因转移方法,在于由一定植故的无性组织或器官再生出充分分化了的植物的能力。再生植物的起始物质,可以是叶片或茎块,甚至可用培养中的各种未分化的细胞块,在一些种内,也可以用单一细胞作起始物。

相对讲,研究开发无性方法转移植物基因的工作开展较晚,细胞融合技术的研究约有20年历史了。利用重组DNA技术,可很快得到农业上有用作物变种,这在1983年已实现了。目前,还没有任何可以想象的农业有用特性通过无性方法转化到作物中例子;用无性方法获得的植物种,也没有能在商业农业中得到应用,1986年,开创了第一块用于实验经重组转化了基因作物的实验田,由此可见,用无性方法改良物,还处于幼年期;但是一些方法,已显示出了对未来作物改良的巨大潜力。

细胞融合   六十年代,发展了一种脱掉大量细胞壁,制备原生质体的方法,把不同种的原生质体放在一定化学药品或电流下,诱导其融合。可对融合产生的杂种细胞进行试管培养,由一定种所产生的愈伤组织中再生出整个植株,这样可使性不一致的染色体相结合;或更简单些,使一个种的核染色体组和另外种的细胞质(即细胞器基因组)相结合。在过去的20年间,为使细胞融合成为不同种间基因转移的有效方法,已付出了不少努力;也同时发现了许多问题,还很少在商业农业中应用。

细胞融合法的最大潜力,是可创造出在一个种的细胞质中含有另外种核基因组的新作物(核转移);或产生出具有混合两个种细胞器细胞质的新作物(细胞杂合体)。植物线粒体和叶绿体,分别具有为组织结构和细胞器代谢机器的蛋白质编码的DNA(发现在细胞器内的大部分蛋白质是输入的,是由核基因编码的)。一定的农业上的重要特性,是产生自核基因组和细胞质染色体组之间的相互作用,如雄性不育商品种子,就是由核和细胞质线粒体之间的相互作用产生的。细胞质雄性不育不能自然出现,而是把核和细胞质基因组进行人工结合而产生的。得到详细研究的,是烟草、油菜的梭染色体组和萝卜细胞质的结合。

有关细胞融合方法的报道不少,结果是显而易见,但也有许多问题有待解决。如伴随性的杂交,亲本种间的不相容性,可造成杂种的不稳定性。正如上述,不相容性可在几个水平上出现,体细胞融合可减轻不相容程度,但并不能解决所有可能问题。融合也可严重危及所产生细胞的再生能力。细胞融合方法本身的困难,也是不利因素。和为有用特性编码的基因相连的有害基因也将被转移。在目标是核基因组所编码特性的万一情况下,选择有用特性就更加困难,因为在经融合得到的杂种内,除了核基因之外,细胞质基因也是混杂的。和性杂交一样,基于细胞融合的基因转移方法,产生许多基因的转移。为了得到具有结合了亲本特性的植物,把得到的杂种进行回交或采用其他有性方法仍是必要的。

通过DNA直接操作的基因转移  四十年代,继事定了DNA为遗传的化学基础之后,开始了把DNA由一种微生物中直接转化到另一种的实验,1973年、基因拼接的重组DNA在试管内得到证实以前,就对由细菌的性因子(质粒)、病毒(转导噬菌体)以及直接吸收纯化DNA而转化的基因或染色体片断了解得很清楚了,病毒转导的基因转移,直接的DNA吸收和微量注射已成功应用于动物细胞,也同样发展应用于植物细胞,但最先进的,还要属细菌把DNA介导进了高等植物内。

无性DNA转移技术,使所有育种技术或细胞融合技术之外的基因操作成为可能,能直接把基因从外源动植物、细菌或病毒中导入作物内。因为DNA片断能控制基因表达,所以在新寄主内往往必须经过适当的功能修饰,才可对调速、组织特异性和基因表达水平进行控制。因工程基因的重新介入,可使内源植物基因重新编排。这样以来,无性DNA转移方法,扩大了对包括所有生物在内的植物改良有用的变异范围,并可通过操作达到在数量上控制基因表达,结合化学合成DNA的技术或自然出现的基因内引起的突变,可以利用完全新的基因。所有这一切,原则上都要准确无误才行。

农杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移   这是利用了根癌农杆菌(A. tumefaciens)的自然能力转化DNA到植物染色体内的方法。根癌农杆菌是一种植物致病菌,它在高等植物(包括双子叶作物)中有广泛的寄主范围,它能把Ti质粒(也叫T-DNA)编码的一套基因转化到受伤位置的植物细胞中。转化的结果,一般是形成根癌,T-DNA被稳定地整合进寄主染色体内,整合位点是随机出现。根癌表型,产生自T-DNA上的基因表达,保持组织培养中的不一致性,使正常生长失去平衡。而T-DNA内的基因缺失,可以消除引起根癌的能力,但并不影响基因转移和整合功能。在失去致病力的农杆菌内,转化的DNA被吸附到为整合T-DNA终点的边沿序列上面。农杆菌在激活T-DNA转移的同时,也必须表达一全套在Ti质粒上编码的有毒基因。

在实验室内,可利用失去致病力的农杆菌把基因转移到部分再生的细胞、悬浮细胞培养物、叶片或茎块的原生质体内,关键是从整合了T-DNA的细胞中恢复整个植株。利用可选择的标记,促使或统一细胞生长。例如,T-DNA内被转化的基因和提供抗菌素(如卡那霉素)抗性基因相连,抗菌素能阻碍细胞生长。只有那些含有工程T-DNA的植物,才能在卡那霉素的存在下正常生长。

通过工程农杆菌转移基因的方法,已在实验室内普遍用于龙葵科,如烟草、番茄、和矮牵牛属的植物。由于根癌农杆菌不能诱发单子叶植物形成根癌,所以对稻子,玉米、小麦等重要作物,正在研究其他的基因转移方法。

农杆菌牛导的基因转移在农业上的应用   自应用这种方法的4年来,取得了令人鼓舞的进展,被成功转移的有抗病虫害基因和对除诱剂的安全基因。这是无性基因转移方法具有实用价值的证据。正在进一步实验,供农业选用。

利用重组DNA改良作物的早期目标,是用工程细菌或植物基因编码的酶,使植物耐宽光谱,对环境中的除莠剂安全。因为除莠剂可以抑制植物的酶活性,已成功地把对除莠剂不敏感的酶编码的细菌基因转移到了作物中,另外,植物基因本身经操作后,也能产生大量耐除莠剂的酶;再就是使工程植物表达能使化学除莠剂解毒的基因。

把苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的产生杀虫剂蛋白质的基因转移进作物内,并取得了令人满意的结果。当某些虫子以这些植物为食时,就会被植物组织内的细菌毒素杀死。杀虫剂蛋白质得到广泛实验,非常安全。

用烟草花叶病毒编码蛋白质外壳的工程植物,是在农业上取得的未预料到的令人激动的成果。这种基因在烟草、番茄中表达,对病毒感染产生抗性,其机制尚不清楚。可如果是普遍结果的话,我们就会很快地开始控制植物病毒感染的新的遗传研究。利用杀虫剂对付虫害,进一步扩大研究对付植物病毒。至今,用化学药品防止和治疗植物病毒感染的研究尚未成功。

总之,实验证实,当一个有用特性由农杆菌介导进植物中时,产生的工程植物可预测、遗传稳定,并且是有用的。

直接的DNA转移   通过直接吸收和微量注射,可把纯化的DNA直接转化到植物内。直接的DNA吸收,包括了DNA进入原生质体过程中的物理化学反应,微量注射就是利用显微镜吸管,机械地把DNA引入细胞内。和基于农杆菌系统的方法不同,直接的基因转移方法并不受寄主范围的限制。但在实际上,却受到了从要求目标细胞或组织恢复整个植株的限制。

植物的原生质体能够直接从培养基中吸取核酸,由病毒RNAs首先证实了这一现象。相对讲,通过直接吸收整合外源DNA到植物染色体中的几率较低。如用聚乙二醇或电脉冲加以处理,使细胞膜渗透性增加,可使转化率提高到1‰,结合使用几种提高吸收的方法,可使转化率提高到1%。

随着转化率提高到约1%,直接吸收方法逐渐令人刮目相看。允其对那些对农杆菌感染不敏感,或是不能有效转化基因的作物种来讲,如果能从原生质体中再生植株的话,那么直接DNA吸收就成了一个很好的备用方法了。尽管也用直接的DNA吸收方法对其他作物细胞和组织进行过实验,但至今成功的还仅限于原生质体,所以从原生质体再生整个植株的直接吸收DNA技术的应用受到限制。但最近已有了从水稻原生质体得到整个植株的报道;另有报道指出,通过电脉冲处理,进入水稻原生质体的外来基因得到表达;还有报道说,通过直接的DNA吸收,已稳定了所形成的玉米细胞系。这样看来,通过直接DNA吸收生产工程植物的前景是更为诱人的。

微量注射法   在所有转化植物基因的技术中,最新的方法,是把DNA溶液在加压下微量注射到植物原生质体内。成功的关键,是注射过程中细胞的固定以及后来的培养。在一项研究中,由微量注射的烟草原生质体培养的缩胞系显示,有整合进核DNA内的外来DNA序列;平均转化率,核内注射的为14%,细胞质内注射的为6%;另一项研究指示,由核内注射的苜蓿原生质体培养形成的细胞系,通过筛选,确定有由外来DNA编码的酶活,转化率在15 ~ 26%范围内。至今,从用原生质体微量注射获得的细胞系中再生出植株的报道尚未见到,关于这一点,重要的是已有经微量注射细胞的存活。结合直接的DNA吸收,原则上讲,微量注射法可用于能从转化的单一细胞恢复整个植株的任何作物的基因转移。

病毒介导的基因转移   为了实验和治疗目的,已发展了基于病毒基因表达的动物基因转移系统;同样,对以植物病毒为载体转化基因到植物中的研究也作出了努力。在植物中,基于病毒的载体似乎不能稳定地形成细胞,因为还没确定病毒基因是否能整合到植物细胞的染色体内。原则上,工程病毒能在整个植株中扩散,使提供新特性的基因得到表达。在设计载体时,把由菜花花叶病毒双股DNA的表达和病毒粒子装配严格需要的条件全部考虑在内了。并由最近从利用农杆菌介导感染玉米的病毒到植物中的结果指示,病毒介导植物基因是有可能的,病毒介导的植物基因将有助于农业,但并不是近期就可以实现的。

重组技术的问泄,吸引了科学政策的注意力到种属间的基因转移上面。然而正如上述,在植物中,尤其是在上一世纪的作物改良中、种属间的基因转移并不鲜见。出现的重组转移基因的方法,处于对作物改良更有效方法的日益发展的领先地位上。

作物改良为美国农业的发展和经济强化奠定了基础。技术革命和不断发展的基础科学有效地指导着作物改良,进一步繁荣农业,并继续保持农业在国民经济中的重要作用,在于有效而明智的采用新技术。研究投资和其他政策,都深刻影响着私人和公共农业研究机构在作物改良中对新技术的采用。

研究和公共政策议程   把严格特征化了的基因加入到经育种人员研究的特殊作物的先存种质中,新的遗传工程技术具有潜力可挖。尽管结果的取得可能需要巨大的经济投资,每增加一项要求或把基因回复到作物内,都必须考虑到要付出十万倍的艰巨努力。但大量等位基因的表达,可提供许多有用特性或表型。为了按要求的方式改变植物特性,必须选择正确基因进行操作,这种选择,必须是建立在对带有特性的生物化学基本过程的了解之上。

研究投资,要使各学科达到通力协作、主要集中加强对先进基础理论的研究,确保技术的先进性。近年来农业研究团体给予了充分重视,以满足植物育种竞争时要求和分子生物学对紧缺资源的要求。

许多事实说明,重组DNA的研究,是建立在过去植物育种和遗传取得的成就之上。经植物育种产生的优良作物,为实验室内研究出的新基因的导入提供了遗传背景。分子生物学家们正在利用同基因系列(即在单一性状不同的植物)分离关系抗病特性的基因。四十年代,首先对易变基因成分进行了遗传学和细胞遗传学分析;已用于从玉米的变种中分离特殊基因。

在用新方法提高育种水平方面潜力巨大。现在,对许多遗传座位的测定,仅能在成熟植物中进行。如果是对能决定后来性状变化的遗传坐位,在胚阶段就可以测出的话,那么就可以减小实验田,而对胚进行选择;或可以加速育种程序,不需要全部培养季节,就可以得出结果;根据限制片断长度多态性,能确定克隆基因和插入DNA片断的特殊的染色体位置标记,可由此绘制出许多作物的高级遗传图。这些图既可以作为新的遗传标记帮助育种人员评价杂交结果,也可以使植物遗传学家们对那些和已知标记有联系的潜伏的重要基因进行分离。

使用高级遗传图和传统的细胞遗传学技术,可以把基因从显微解剖的染色体内分离出来。这些新技术,不仅可以分离包括抗病基因在内的一些很少得到特征描述的基因,而且可以扩大有关染色体的结构和影响基因表达方面的知识,在使用先进的DNA重组技术转化基因的同时,也使细胞遗传学得到了进一步的发展,通过微量注射特异染色体的基因转移法,可以转移复杂多基因特性。这些转移如能成功的话,都可以作为更广泛种间杂交的有用方法,结果会使种的范围大大扩大。

已广泛讨论了利用DNA重组技术涉及到的一切问题,从非凡的技术力量,由新方法修饰后微生物产生不可估计的行为;过去40年中使用化学药品的实验中全盘考虑,应该慎重合理地按确定要求引进经遗传修饰的微生物。管理机构应该对科学组织进行全面了解,并适当纠正可能的冒险和奖酬。如上所述,有过去在作物种间基因转移的成功经验,对有关问题是不用担心的。

最后,考虑到转移基因的技术,关键是收集、保存和对世界上的植物及微生物的种质进行特征描述,未来的科学家们将会采用许多提高农业的更先进技术,创造出难以估计的农业成果。我们必须为子孙后代的工作创造条件,积累材料。

[Science,1987年4月3日]