导 言

1926年，James B. Sumner结晶出尿酶，并发现它是一类蛋白屑。此后经过10年的争论才认识到，生物体内几乎所有的生化反应均由蛋白酶催化。由此，酶是蛋白质的概念便深深地植入生物学工作者的脑海长达半个世纪之久。

然而，在1981-1982年期间，我的研究小组扣我一起发现了另一种酶——RNA分子，它能切割和连接自身的核苷酸。

为什么选用四膜虫为研究材料？

早在70年代以前，对于真核生物染色体的结构与功能方面的研究大多以整个基因组为实验系统。这种泛泛的研究逐渐引起我的不满，于是便把焦点汇聚在详细分析和研究某个特殊基因的结构与表达的前景问题上。1978年我开始从事纤毛原生动物rDNA（编码rRNA的基因）的研究工作。

纤毛原生动物四膜虫（Tetrahymena）有两个细胞核。小核与生殖过程有关；大核在营养生长过程中专司基因转录，它有两个特点：（1）编码rRNA的几个基因位于核仁中的一些小分子DNA上；（2）转录时，该基因扩增约10，000多个拷贝。然而，这并非是诱惑我们的主要力量，吸引我们的真正原因在于，首先能分离出该基因；其次能分离出与该基因有关的结构蛋白和调控转录的蛋白；第三，对该基因的表达与调控进行研究。

四膜虫rDNA的一个特征是，其中存在一段插入序列（Intervening Sequence，缩写为IVS；又叫Intron，内含子），它把rDNA中rRNA的编码序列间隔开来。两年前，IVS已为麻省理工学院和冷泉港的三位学者在黑腹果蝇编码28sRNA基因中发现，因此，寻找另一段IVS几乎不是分散我们对调节rDNA转录蛋白的研究计划的原因。

RNA的体外拼接

首先，通过转录过程的生化分析，我们想知道在无细胞粗提取系统中，rRNA的合成是否可以进行。从四膜虫（T. thermophila）体内分离出细胞大核，其中含有RNA聚合酶及rRNA染色质模板。然后将之与转录必需的底物和一些无机盐混合在一起。此外，还需加入α - 鹅膏蕈碱和蕈毒素，它们能抑制转录mRNA、tRNA和其他小分子核RNA（snRNA）聚合酶活性。这样，我们就可以潜心从事大的rRNA片段的合成研究。

用凝胶电泳分离这些体外转录反应产物时发现，它们是一组有一定程度异源性的高分子量RNA（≥26 s），其大小如同预期的全长前体rRNA分子。此外，有一个低分子量的分离产物（约9 s）。后经实验证实，该小分子RNA是在转录后产生的，于是我们推断，这个小分子RNA似乎有可能是前体rRNA在成熟加工过程中被切除的几个短小片段之一。这些候选序列包括一个5'端外部的转录片段，几个5.8 srRNA侧异的内部转录序列和IVS（图1）。

这些实验结果对我们的研究目标非常重要。受比此信念更有甚之的好奇心驱使，我鼓励Art Zaug分析编码该小分子RNA的DNA序列。他进而证实，这个小分子是由rRNA基因编码，并根据rRNA基因序列绘制出IVS的物理图谱。

实验数据令人大喜过望：作为前体rRNA（pre-rRNA）—部分而合成的IVS，在我们的体外转录反应中明显是体外条件下从pre-rRNA分子上被切割下来的。当时，只在酵母中发现过前体RNA，并对其拼接机制产生过极大兴趣。尽管如此，体外发生的rRNA拼接现象已得到确认。似有理由认为，四膜虫的rRNA拼接与酵母tRNA的拼接遵循着极不相同的拼接模式。

此外，在每一个四膜虫细胞中，约有10⁴个相同的基因，每一个产生未拼接的pre-rRNA的速率为：1拷贝/细胞 · 秒。据此我推断，细胞核也许含有异常高浓度的拼接酶，才能催化如此高丰度的拼接反应。因此则易于分离出这种拼接酶。我们几乎没有猜到，这种拼接“酶”并非传统观念的酶。然而，某种更有趣的东西正在向我们招手。

未曾顿悟的自拼接现象

实现纯化拼接酶的设想采用的是常规方法，首先摸索pre-rRNA转录但拼接反应受抑制的反应条件，纯化转录反应后累积起来的pre-rRNA，以做底物之用。其次，制备含拼接活性的四膜虫核提取物，体外用之处理纯化了的pre-rRNA，然后走凝胶电泳检测拼接反应。第三，制备核提取物进一步纯化的具拼接活性的亚组分单位，最终分离出拼接酶。

Art Zuag用标准的SDS－酚焠取法没费多大功夫便分离和纯化出未经拼接的pre-rRNA。把底物pre-rRNA和细胞核提取物溶解在简单的盐及核苷酸溶液里，该溶液与早期我们用完整细胞核体外有效转录和拼接rRNA所用的溶液完全相同，从而建立了一套反应测试系统。在另一系统里，去掉核抽提物，使之仅含有其他与上述系统相同的组分，把它作为“无拼接”反应的对照系统。

初次尝试获得了成功，在含有焠取物的反应系统中，pre-rRNA的电泳图谱出现了IVS小分子RNA带型。然而令人惊异的是，对照系统也出现了相同的IVS电泳带。于是我问Zuag，“喂，Art，看来实验结果很令人鼓舞，除非你在制备对照系统时犯了某种错误”。可是，后来进行的数次十分精细的、确凿无误的重复试验都得出同样的结果：（从pre-rRNA中）释放出IVS完全不需要细胞核焠取物。由此可见，拼接反应显然无需任何酶的参与。我们根本就没有观察到RNA拼接；称作“前体”的rRNA也许已在体内产生了拼接，我们所观察到的拼接现象只是IVS从经过了拼接的rRNA中的某种分离或释放过程。我们揭示的只是体外发生的化学转变，这种化学反应与活细内的切割和联结反应完全相同。倘若仅仅如此，就值得进一步探索拼接反应。我们居然不得不对RNA的化学性质做更多的了解了。

额外核苷酸G的神秘面纱

为了证实核内RNA拼接的准确性，我们决计测定IVS RNA的核苷酸序列。当Art Zuag用³²P标记该RNA5'端，且置之于测序反应的控制之下时，他得到的序列测定结果是5'- GAAAUAGNAA…（N表示未检出的核苷酸）。早些时候，已有人（如Gall等）分别报道过T，pig-mentosa和T. thermophila的外显子 - IVS联结区域的DNA序列。在后者中，由DNA序列推断，IVSR NA5'端序列始于5'-AAAUAGCAA …。

于是，除了5'端多了一个G残基外，我们测定的RNA序列与DNA序列完全相同。借助几种酶处理法和色谱系统分析法，Art Zuag对这一末端核苷酸进行了慎之又慎的检测，直到实验结果毋庸置疑时为止：IVS RNA起始于普通的乌苷残基，通过像由RNA聚合酶催化产生的标准的3'—5'磷酸二酯键与下一个核苷酸相连。很显然的测定结果有误。我打电话告知Gall，他们测定的该序列大多是正确的，但恰在IVS5'端显然丢失了一个G残基。令我大吃一惊的是，他们居然坚信自己的实验数据不会有错。该DNA序列一清二楚，至少在5'端区域是这样，在5'拼接处根本不可能存有G残基。

大约同时，我进行了对从pre-rRNA中释放IVS所必须的最小序列单元的详细分析。起初对“转录鸡尾酒”进行了一些实验，该转录混合物含有构建RNA片段的四种核苷三磷酸。我首先发现，从四种组分中排除三种NTPs对拼接反应没有影响；但却需要μM浓度级的第四种核苷酸——GTP；其次，IVS的释放需要MgCl₂，某些盐类物质[如（NH₄）₂ SO₄]可促进拼接反应。

在我们简单的体外系统中，IVS释放所需要的核苷酸GTP也是经切割的IVS5'端出现的始料未及的那个核苷酸，这是一种偶然的巧合现象吗？不然的话，二者之间是否也许存在一种因果关系呢？由此提出—个显而易见的假说，拼接反应发生时需要GTP，便使它能被渗入IVS的5'末端。验证假设的方法极为简单，把经³²P标记的GTP与未标记的pre-rRNA混合起来，然后寻找与拼接反应发生同时是否产生有标记的IVS RNA产物。这是我曾做过的最难以理解和接受的实验。一方面，它的成功将会对我们现存的知识体系产生一个直接启示；另一方面，期望核苷酸与经过酚焠取和蛋白酶处理的RNA的简单混合物可能导致共价键的形成，似乎是令人难以置信的天真和不现实的念头。当然，我不愿当实验失败后在我的研究生和同事面前陷入窘境，所以我一声不吭地单干起来。

次日，我将反应结果电泳和进行放射自显影，然后冲洗了X光感光胶片。在加MgCl₂的含³²P-GTP的样品里，在IVS RNA位置处有一明显的放射活性带，而在不加MgCl₂含³²P-GTP的样品里，以及另一含有用³²P-ATP代换³²P-GTP的样品里，却没有出现标记的IVS带。

以后的几星期，我确认了该反应的几个主要特征：（1）GTP的渗入是可以化学计量的，1 GTP/IVS RNA；（2）通过常规的3'—5'磷酸二酯键，GTP准确地渗入IVS的5'端。（3）GTP并非反应必需之底物，GMP甚至鸟嘌呤核苷均有活性。最后一点排除了一个似极有道理的假设：正如噬菌体T₄RNA连接酶要利用ATP那样，GTP将为联结过程提供能源。若果真如此，不含磷酸酐的鸟嘌呤核苷和GMP就没有活性。

经过短促地思考，勾勒出一个简单的拼接途径，它概括了我们关于拼接反应的全新内容，鸟嘌呤核苷加到5'拼接位点的磷原子上这一过程一定发生了一次磷酸酯的转移或转酰基反应（图2）。经过这样一个反应就释放出其5'端的外显子，在其3'端剩余一个新的3'-OH。从这推测的中间物过度到最终观察到的产物的最简捷方式就是要借助一个二次转酰基反应：5'外显子的3'-OH向3'拼接位点的转移。于是，一个能促进转酰基作用的单一活性部位可能是该完整拼接反应的原因。

自1981年我们首次描述拼接反应以来，图2的反应模式几乎没有什么改变。1982年我们又绘制出一张比它更详细的拼接反应阐释图。从那时起，它一直是大量的其他受IVS催化反应的理想模式图。此外，该模式已得到推测的反应中间物的分离和鉴定、拼接反应显然具有可逆性以及其立体化学过程测定结果的强有力支持。

对自拼接现象的悟性

鸟苷渗入反应给我们提供了所需的证据，在简单的体外拼接反应中发生着专一性的RNA键的断裂和形成过程。在极无活性的分子之间发生的这样一个化学上难以进行的反应必定受到催化作用。但是，催化剂是什么？

我们最初的假设是，拼接活性是一种蛋白质所起的作用，它紧紧地束缚（也许甚至是共价键合）在从四膜虫细胞核中分离出来的Pre-rRNA上。也许正是一个极其异同寻常的蛋白质－RNA复合物，它能在我们使之经历多种方式的极端处理后幸存下来：在洗涤剂SDS溶液中煮沸核提取液；在高达65°C温度下用SDS－酚焠取核提取液；用几种非专一性的蛋白酶大规模处理核提取液。我们提出的假说清楚地表明，我们受最一般观念的影响有多么深刻，即只有蛋白质才能是非常有效和专一的生物催化剂。

我们还提出了另一假设：我们也能够以一个更简单的方式解释拼接活性对酚焠取、SDS和蛋白酶处理的抗性。rRNA前体也许不用蛋白酶参与就能发生拼接反应。RNA链可能以某种方式折叠形成一个或一些活性部位，它（或它们）束缚住鸟苷辅因子，并催化各种化学键的断裂和形成反应。在反应过程中（如游离的IVS）产生的RNA分子之一若能维系其活性，并催化其他拼接反应，那它就是一个RNA酶的例子。

当我们试图检测接合在pre-rRNA上的蛋白质而获得日益增多的否定结果时，选择“唯RNA”的假设之魅力似乎与日俱增。但是，我们怎样才能得到一个肯定的实验结果来证明这一点呢？

我们能够设计的最佳方案是，要尽可能以人工合成的方式获得pre-rRNA。这样它就从不会与四膜虫细胞接触过，而后者以前一直是我们制备pre-rRNA的唯一材料。完全化学合成一种pre-rRNA（或甚至IVS）大小的RNA分子过去是，至今依然是技术上力所不及的事情。理想的方法是用纯化的RNA聚合酶，以重组DNA为模板合成pre-rRNA。

当时在Kelly Kruger领导的实验室里正在构建一个细菌质粒，它编码IVS和一部分侧异rRNA序列，大肠杆菌RNA聚合酶可以完成这种结构质粒的转录过程。我们的初衷是，要使大量合成用来分离拼接酶的pre-rRNA方便易行。然而，克隆计划耗时之长出乎我们任何人的预料，以至当1982年早些时候完成之前，我们对把该质粒用于另一目的——为自拼接试验制备pre-rRNA——几乎不抱什么希望了。

在大肠杆菌中质粒经过扩增后，谨慎地脱去蛋A，与纯化的大肠杆菌RNA聚合酶混合在一起，置于已知的可以抑制拼接反应的体外转录系统然后将聚合酶变性，在变性条件下进行凝胶电泳纯化合成的RNA。在加入GTP、MgCl₂和盐时，从人工合成的缩短的pre-rRNA上释放出IVS RNA。GTP断裂RNA链的位点正是用做体内5'端的拼接位置，从而证明，体外发生的自拼接反应与活细胞中的拼接反应有关。

我们举行了一次温文尔雅的庆贺仪式。在啜饮香槟的间隙里，我编撰了一个能够降低某些专一性生化反应活化能的RNA分子可能的目录。正是彼时，我发明了术语“核酶（riboenzyme）”，用来表述一类具有类酶特性的核糖核酸。

（待续）

* T. R. Cech生于1947年12月8日，于1970年在依阿华格林奈尔（Grinnell）学院专攻化学，获学士学位。1975年在加州大学伯克利（Berkeley）分校取得博士学位。之后赴麻省理工学院生物系从审博士后研究。］978年进入位于布尔德（Boulder）的科罗拉多州立大学化学及生物化学系、1981年他发现了RNA的自拼接现象，并在继后的几年中揭示了RNA分子的催化机理，从而荣膺1989年度的诺贝尔化学奖。