高等植物基因转移技术的发展已经导致了植保工作的重大进步，同时促进了DNA重组技术的应用。除了植物基因工程外，植物生物工程学者们对利用植物病毒来表达外源基因的可能性引起了兴趣。然而，必须指出的是，谙熟所使用的工程病毒的组成是一项重要的安全问题。

植物生物工程的一个研究重点即直接针对通过减少由杂草或病虫害，如病毒、昆虫、细菌、真菌以及线虫所引起的减产而提高作物产量。另一重点则在于提高作物对逆境的抗性。自然，人们更期望能通过对作物的修饰而扩大其产品的种类和组成，如：具有优质结构和贮藏性能的淀粉，不含特定脂肪酸的特殊植物油，由多种营养平衡的氨基酸组成的蛋白质，以及纤维、橡胶、树胶等多聚物。同时，植物具有提供与人类健康有关的外源蛋白的潜力：如神经多肽、生长激素、血液因子和抗体等。至于在植物体内导入固氮能力这一振奋人心的设想，则无疑具有巨大的经济价值。

为了达到这些目标而利用DNA重组技术对作物进行改良，在高等植物的基因转移技术中取得了巨大的进步。而作为常规植物转化技术的一种改进，利用植物病毒进行外源基因的表达，将对植物生物工程作出重大贡献。

高等植物基因转移方法

1. 根癌农杆菌参与的基因转移

根癌农杆菌具有将位于Ti质粒上T-DNA中的遗传信息转移和插入到处于肿瘤发育阶段的植物细胞染色体中的能力。这一能力已被用来在高等植物中建立一套简便而高效的基因转移技术。

通常，植物转化载体包含有在根癌农杆菌和大肠杆菌中都有效的启动子，以及一个供筛选用的抗生素抗性基因。在T-DNA的左、右边界内，则存在一个只有当转入到植物细胞内才有效的第二选择标记基因（如编码抗生素抗性或除草剂抗性的基因）。当然，同时$包含外源目的基因。当载体在大肠杆菌中克隆成功以后，就被导入到带有D-Ti（即切除T-DNA的质粒）的根癌农杆菌菌株中，然后即可用它去接种植物外植体或组织。D-Ti的侵入性基因产物使位于转化载体T-DNA边界内的DNA易于进入植物细胞，同时将它插入到其中一条染色体中。第二选择标记基因的随后表达在植株再生过程中便可以用来对已转化细胞的选择。

2. 基因直接转移

基因直接转移是在应用上述方法对一些重要的经济作物如禾谷类作物进行处理时遇到了困难而发展起来的。它指的是利用一定手段将游离的DNA直接导入植物细胞中。这些手段包括：（1）内含DNA的脂质体与植物原生质体的融合；（2）显微注射；（3）在DNA存在情况下用磷酸钙和/或PEG处理原生质体；（4）电穿孔法，然而不幸的是利用这些方法却受到如下事实的极大限制，即很难从已转化的单细胞诱导再生出完整植株。从这一角度看，上述最后一种方法，即利用粒子枪轰击将DNA直接注入植物细胞的方法，可能更有希望，因为它可以转化整体组织中的细胞，从而便容易获得再生植株。

根癌农杆菌参与的基因转移方法在植保和作物改良上的应用

1. 除草剂耐受性

因为除草剂往往缺乏选择性，所以便限制了它们在诞生初期的应用。人们正努力改变作物的性状以使它们能抗广谱的除草剂。为了达到这个目的，人们采用了三种不同的方法：（1）生产超量的靶酶；（2）产生变性的靶酶，使其对除草剂的敏感性降低；（3）引入一编码解毒或降解除草剂的酶的基因。利用从植物或微生物中分离到的多种基因结合上述某一种方法，人们已经得到分别抗阿特拉津、溴草腈、2，4 - 二氯苯氧乙酸、草甘膦和磺酰脲等除草剂的作物。

2. 病毒病抗性

在作物保护中，为了抵抗病毒、卫星病毒及类病毒的侵染而正施行交叉保护的方法。简单地说，也就是利用对植株接种温和型病源株来阻止日后更多的同一病源的有毒株侵染而引起的严重病害的发生，因为人们发现这一方法在农业上的广泛使用存在很多缺陷，而表达了烟草花叶病毒外壳蛋白基因（TMV CP gene）的植株具TMV抗性，这引起了人们的兴趣。大田试验获得的这一对病毒病良好控制的结果，表明这一策略在农业上具有潜在的应用价值。随后，人们发现由CP参与的抗性对多种病毒有效，包括苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、豌豆早枯病毒、马铃薯S病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草线条病毒等。最近，人们已将TMV的54 KDa非结构蛋白基因转化到植物中以估计它的作用。引人注目的是，这些植株对TMV表现了完全的抗性。人们还观察到表达CMV和TRV病毒随体RNA的植株的相应病症减轻。然而，这一方法的潜在使用价值还值得怀疑，因为随体RNA在病毒感染植株时可能“逃跑”而去感染其它作物，并导致坏死病的发生。人们目前还在设想用其它方法来操纵植物对病毒病的抗性，这些设想包括：利用病毒基因组复制启动子的可能性；利用修饰的缺损干扰RNA去干扰病毒基因组的复制；以及利用核酸代酶选择性剪切病毒RNA的特殊位点等。

8. 昆虫抗性

考虑到由昆虫引起的世界性的减产以及对其防御所花费的昂贵代价，在植物中操纵昆虫抗性的成功代表了另一个重要的进步。事实表明，转化了编码苏云金杆菌内毒素基因的植株存在抗虫活性，获得了昆虫抗性。最初大田试验中观察到的这一对昆虫的成功控制表明这一策略在农业上具有潜在的使用价值。另外一些手段在于利用植物抵抗昆虫的自然防御体制。其中之一即利用胰蛋白酶抑制因子（来自豇豆），已发现转化了编码这一抑制因子基因的植株对昆虫袭击具有抗性。

4. 改良作物性状的基因修饰表达

随着植物基因的识别和分离技术的进步，以及对精细的时空基因调节必需的顺序的了解，人们已能在植物的生长和发育过程中，通过精确的基因修饰，使特定的组织转变成具有设想的特性。比如说：在烟草和油菜中表达的嵌合RNA酶基因，在一烟草绒毡层器官专一基因5'端的控制下，可以在花药发育过程中选择性地破坏绒毡层，抑止花粉形成，从而导致雄性不育。这一成果代表了为改良作物而进行杂交种子生产所作出的一个重要贡献。

病毒基因组参与的外源基因在植物中的表达

植物病毒学已为植物遗传工程的基因构建作出了重大的贡献。它提供了来自病毒基因组的工具，比如说来自花椰菜花叶病毒的35s启动子。除了常规的植物转化方法外，利用由工程病毒参与的外源基因在植物体内的表达对生物工程研究来说同样值得考虑，因为它具有如下迷人的特点：（1）整株植物的系统感染避免了其它方法困难重重而又费时的转化和再生过程；（2））因为病毒在植物细胞中是作为高拷贝的自主体而增殖，所以任何插入到病毒基因组中的外源基因在复制过程中都将扩增；（3）在病毒基因组参与下的外源基因表达不会像其他无规则地将基因插入到植物染色体中那样遇到“位置”效应；（4）工程病毒的使用具有灵活性，可快速更换欲表达的基因；（5）可以选择接种病毒的时间使有关的基因在特定的植物生长发育状态表达；（6）最后，病毒基因组参与的外源基因表达，可以快速地（接种后几天内）检测修饰蛋白的表达情况以及它的功能。因此，构建植物病毒基因组以此作为表达载体将越来越引起人们的兴趣。

1. 来自DNA病毒的表达载体

早期很多以植物病毒基因组作为表达载体的工作集中于花椰菜花叶病毒，因为人们对这一病毒较为了解，它包含单个双链DNA的基因组，在机械接种情况下存在感染性。但是，其复制和基因表达以及装配的复杂性严重限制了将外源DNA插入其基因组。而且花椰菜花叶病毒的宿主仅限于少数的几种双子叶植物。然而，人们利用更换开放阅读片段Ⅱ（其产物对昆虫传播有作用而对复制和系统感染无效）构建了携带有编码二氢叶酸还原酶和金属巯基组氨酸三甲基内盐Ⅱ小基因的载体。这一载体在机械接种情况下确实可以系统感染芜菁植株并高度表达外源基因。

由此，人们的注意力便集中到双生病毒（geminiviruses），为它可以感染包括单子叶植物在内的多种植物。这些病毒的基因组可以是单组分或双组分的环状单链DNA分子组成，总的来说，依靠叶蝉来传播的双生病毒通常为单组分环状基因组，如玉米线条病毒、小麦矮缩病毒等，并可同时感染单子叶和双子叶植物，而依靠白蝇（粉虱科）传播的双生病毒则具2个分别标记为A和B的环状基因组，如木薯潜病毒、番茄金黄花叶病毒等，它们只感染双子叶植物。虽然使用某一特定病毒基因组克隆化的双链DNA拷贝可以用机械接种的方式感染宿主植物，人们设计了更有效的方法，即农杆菌法接种，或称农杆菌法感染。它指的是将代表病屯毒基因组二聚体的DNA克隆到根癌农杆菌的T-DNA中，然后用此构建菌株接种宿主植物。病毒基因组即可以某种方式“脱离”T-DNA而引起整体植株的系统感染。

2. 来源于RNA病毒基因组的表达载体

植物病毒中主要的含有正链RNA的众多病毒，或许具有发展更加多方面表达载体的潜力。人们已仔细地研究了它们的基因结构、复制以及基因表达机制。它们的基因组分别由所熟知的单组分、双组分、三组分或四组分RNA分子组成。除了CP基因外，这些病毒基因组还编码非结构蛋白，这些蛋白在病毒的复制、细胞间转移、系统感染以及昆虫传播等方面起作用，这些病毒的复制受依赖于RNA的RNA聚合酶的控制。这些酶部分由病毒基因组编码，病毒基因组的表达具各种策略，如终止密码子抑制，移码和翻译后裂解等。RNA病毒为多基因基因组，“内部”基因通常通过病毒复制酶在复制中合成的亚基因组RNA而表达，而此复制是受位于负极性基因组RNA上的内部启动子促使的。虽然，在自然界中，这些病毒多数靠昆虫传播，已证明机械接种的方法亦可得到高效的感染，人们成功地克隆了很多RNA病毒质粒上基因组相应的cDNA，这些质粒在离体情况下，可以导致感染性转录。这打开了对这些病毒的基因修饰之门，同时使人们能够构建来源于RNA病毒基因组的表达载体。

就操纵番茄花叶病毒（TMV）基因组作为表达载体来说，位于基因组近3'端通过亚基因组RNA表达的CP基因，被CAT基因所代替。当用此构建的嵌合TMVRNA去接种烟草叶子时，观察到了CAT基因的表达。据估计CAT的产生量为每克感染组织中含lug。人们也作了将CAT基因插入到TMV完整基因组的尝试。然而在这种情况下，嵌合病毒基因组并不稳定，在病毒复制过程中，CAT基因被切除。因此，进一步检测携带外源基因的病毒基因组的不稳定性的分子基础将非常重要。

因为RNA病毒在复制过程中按估计有极高的变异率，这些插入到RNA病毒基因组的外源基因的稳定性受到了怀疑。为了进一步分析这一问题，必须检测这些来源于RNA病毒基因组的外源基因在整体植株中几个复制周期的表达情况。这一潜在的问题将限制这些来源于RNA病毒基因组的载体在通过感染植物来生产药物中的使用，因为它导致为了获得人们所期望的多肽产物而不得不增加额外的纯化步骤。然而，这些载体仍然非常有用，它可以在着手进行稳定的植物转化以前快速检测构建蛋白的功能。

关于工程病毒散逸到环境的安全问题

1. 工程病毒传播失控的可能性：一个关心的主要问题

就在植物中表达外源基因的工程病毒在开放环境中的使用而论，这些病毒超出靶区域的失控传播，将对农业构成潜在的威胁。因此，只有在能将这些病毒的增殖限制在靶区域内时，才能用它在植物中表达外源基因。

2. 对病毒控制策略的摸索

要达到上述目标，其中的一条策略即同时构建病毒和宿主基因组，使这些工程病毒只能在受修饰的宿主植物上增殖和表达外源基因。病毒基因组的修饰可以用一目的基因取代病毒增殖中某一必需的基因。这一构建的病毒基因组将阻止该病毒对普通宿主植物的感染。另一方面，从病毒基因组中切下的相关基因可设法转移到宿主植物中，人们可以从中筛选出那些高度表达病毒基因的转基因植株，这些植株即可以补充的方式支持那些含修饰基因组的病毒的增殖。因此在这一组织中，在“繳械”的病毒载体和“辅助”的转基因宿主植物之间存在着强制的互助关系，这便构成了表达外源基因的一个系统。

虽然在理论上说，这一策略对DNA病毒有效，但它却具有如下潜在的危险，即“缴械”病毒基因组与“辅助”宿主植物中的基因通过重组而产生完整感染性的病毒，以及它的散逸。然而，对RNA病毒来说，则易于对付。宿主植物可以用编码非结构蛋白的病?基因来转化，而这些非结构蛋白为病毒的复制、细胞间转移、系统传播所绝对需要。具辅助突变病毒基因组的首例转基因植株已经诞生。

最后，上述表达系统中，RNA重组的可能性也值得一提。因为在“辅助”宿主植物体中的补充病毒在3'和5'端都缺乏复制信号，重组则需要由病毒复制酶产生的模板。它首先要从一“缴械”病毒基因的复制中间体到补充RNA，然后由此再回到复制中间体，这似乎极不可能。作为这一推论的证明，可以指出在具补充TMV运动功能的转基因植株中，接种突变TMV（LS₁）后，至今未发现有野生型TMV出现。另一猜测是当补充RNA受衣壳包被后，它可能“逃跑”。然而在这一情况下，任何非辅助植物都将阻止这一行动，因为补充RNA无法复制自身。

将来，利用重组DNA技术所构建的工程植株，能否在大田中使用，将主要取决于调解、专利和公众理解等非科学性的诸多因素。利用病毒来表达外源基因，进行开放性的使用，尤其当这些工程病毒的“内容”尚未被人们所谙熟时，将更会引起争议。

[FEBS Letter，1991年第281卷第1 ~ 2期]