（华东理工大学）

重组DNA技术曾带动了基因工程、蛋白质工程的发展和一系列分子生物学新方法的创立，这是生命科学发展史上的一次重大飞跃。反义技术则是继重组DNA技术之后兴起的又一门全新的基因工程技术，它从反向遗传学的角度认识结构基因的功能和基因表达的调控，从而为分子遗传学分析、人类疾病的防治以及动植物遗传育种等提供了崭新的手段。作为一项具有重大应用背景的尖端生物技术，反义技术已经同时得到科学界和商界的极大关注，并在过去的十几年中得到迅猛的发展。毫无疑问，在不远的将来，这项从生命本质研究入手的技术必将产生强大的冲击波，在21世纪生命科学的发展中发挥巨大的作用。

一、反义技术的含义

双螺旋DNA由两条互补的DNA链构成，根据在遗传过程中作用的差异可将这两条链区分为正义链和反义链。按照现有的研究内容，对反义技术的定义可作如下概述 :根据碱基互补原则，用生物合成或人工合成的特定互补的DNA或RNA片断（或其衍生物）封闭或抑制目的基因表达的技术。实施反义技术的主体是反义核酸片断。反义核酸包括三类：反义RNA、核糖酶（Ribozyme）和反义DNA。反义RNA是伊萨特（IZant）和魏因特劳伯（Weintraub）等在前人发现的基础上最先提出的一个新概念，它可以通过重组DNA技术得到，也可以进行人工合成。Ribozyme的发现及随后的研究使人们确定了RNA分子可以作为生物催化剂——酶的概念，美国科学家切赫（Cech）和阿尔特曼（Altman）也因在此研究方面的贡献于1989年分享了诺贝尔化学奖。反义DNA§前多采用化学合成法得到，长度一般在8~28 bp，1978年柴门尼克（Zamecnik）首次利用13 bp的反义DNA抑制劳氏肉瘤病毒（RSV）增殖。随后人们逐渐认识到正常的DNA片断在应用上的局限性，如稳定性和细胞通透性等。所以，对天然结构反义DNA片断的进一步加工和修饰技术应运而生，相继出现了甲基磷酸型反义DNA、硫代硫酸型反义DNA、双硫代硫酸型反义DNA、a构型反义DNA以及各种末端化学修饰的反义DNA。有关化学合成、修饰、生物活性检测和临床试验技术的迅速发展是多学科交叉渗透的典范。与三种反义核酸相关的基因治疗技术均已得到了深入的研究，并已近于临床试验，应该说都具有很好的发展潜力。但笔者认为，由于反义DNA的体外可操作性，使之在药物设计、合成、功能多层化和多样化等方面具有更大的优越性。

二、反义技术的机理和特点

反义核酸与靶基因序列的结合遵循碱基配对原则，结合的方式目前推测有两种，一是与靶基因mRNA形成二聚体，二是与双链靶DNA形成三螺旋结构。鉴于这种结合方式，反义核酸阻断基因表达功能的作用途径可能是多方位、多层次的：1、三螺旋结构的形成阻碍了基因复制和转录过程的进行；2、在细胞核内与新生mRNA形成二聚体，导致由细胞核向细胞质的转运无法进行；3、在胞质内与mRNA形成二聚体，使之不能与核糖体结合，阻止了翻译过程；4、与m R-NA形成的二聚体容易被胞内核酸酶降解；5、二聚体的形成导致碱基的再修饰，并引起解链。解链后的mRNA中A变为I，因而改变了原有的密码结构。

从实际应用角度考虑，反义核酸应具备以下几个特性：

1. 序列专一性 反义核酸对靶基因序列的识别能力是作为高效、安全药物或试剂的基础，专一性结合程度与所设计的反义片断长度及其碱基配比有关。反义核酸越长，特异性越高。但作为体外给药时就越困难，因此片断长度一般在8~28 bp之间。碱基在片断中的分配应尽可能均匀且避免设计在一些可能出现较高同源性的位点。

2. 区域有效性 反义片断区域的选取对作用的有效性十分关键。虽然至今仍无普适的规律可循，但诸多有关区域有效性研究的成功先例具有重要的参考价值。

3. 稳定性 细胞内存在着能快速水解反义核酸片断的核酸酶，一般单链核酸片断在组织内的半衰期只有几分钟。因此，稳定性是反义技术实施的一大障碍。为此人们正针对反义核酸的化学修饰和改性方面开展大量探索性却富有成效的研究，目前改进的反义核酸在体内的半衰期已提高至数小时。

4. 细胞通透性 反义核酸属于亲水性化合物，它透过脂质类组织细胞膜进入细胞是较为困难的。虽然这种运输机制尚未得到全面系统的认识，但通过化学修饰引入疏水基团，的确促进了细胞对反义核酸的吸收。

5. 药物学特性 目前已有许多有关反义核酸在动物体内吸收、分配和代谢的研究，并且已经证实了反义核酸具有在数分钟内被快速输送到除大脑以外的所有组织中去的良好的药物动力学特性。但是，药物积累以及可能的药理学副作用特别是经化学修饰改性的反义核酸的毒理学性质，仍需进行大量细致的研究工作来补充和完善，

三、反义技术的应用前景

1. 应用于分子遗传学研究

传统的分子遗传学在微生物和植物研究中较为成功，但在脊椎动物研究方面却存在着严重的缺陷，这主要是因为经典方法所采取的手段是利用基因突变，然后观察和分析子代表型的变化；而脊椎动物生殖期长，繁殖困难，而且基因突变往往导致子代死亡，因此难以获得表型突变的机理。反义技术可以通过靶基因的定点封闭和激活，达到快速分析基因功能的目的。关于这类研究工作的实施方案有三种：（1）将外源反义核酸注入早期胚胎；（2）用反义核酸表达载体转染培养的组织细胞；（3）将反义片断表达基因整合到种系细胞；从而观察基因表达受阻后的表型特征。有关这方面的研究已在果蝇以及小鼠等复杂有机体中获得成功。

2. 应用于人类疾病的治疗

人们已经认识到人类许多疾病的发生和发展都与DNA或RNA有关，遗传病是子代对父母病态基因的继承并呈显性的体现。如癌症往往是人体内原本存在的隐性癌基因在某些条件下被激活或某些正常显性基因受到外界刺激发生突变而导致的，病毒性疾病则是由于病毒RNA或DNA对人体的侵袭而造成的生理代谢异常。因此，如何从基因水平上认识病因并在此水平上实施治疗，已成为全世界所共同关注的重大课题。据美国商用通讯公司预测：1999年反义技术的市场可望达到45亿美元，为此有越来越多的公司和研究部门相继投入了这方面的研究。在病毒性疾病的治疗方面，已开展了有关流感病毒、疱疹病毒、蝉媒脑炎病毒、烟草花叶病毒、鸭肝病毒、乙型肝炎病毒、艾滋病毒和乳头瘤病等的研究。某些病毒核酸序列具有随机可变性，因而给治疗工作设置了重重障碍。如在征服艾滋病进程中就遇到这样一个棘手的问题，针对某一类型的病毒遗传性状所进行的分析结果和计划采取的相应治疗措施还没出台，艾滋病毒已经发生了转型，因而导致前功尽弃。反义技术在这一方面将表现出前所未有的灵活性，它可以及时地通过反义序列的调整而适应病毒的多变性。

如果说，“反义核酸的治疗技术代表着药理学史上的一次革命”，这绝无半点夸张。人类在与癌症这一几乎等于宣判死刑的顽疾进行奋力斗争的过程中逐渐将期盼的目光投向反义技术，例如，在不少肿瘤细胞中均发现c-myc和c-myb基因的扩增异常，采用相应的反义核酸片断的确抑制了相关蛋白质的合成和细胞的增殖。其中涉及到白血病、淋巴癌、乳腺癌及结肠癌等，有关肺癌细胞和膀胱癌细胞在反义核酸作用下受到抑制的研究也已有报道。另外由于动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄、高血压和脑缺血损伤等疾病都存在着细胞增殖和迁移现象。这类现象均受到基因的调控，因而，反义核酸在心脑血管疾病的治疗方面也是很有发展潜力的基因治疗药物。

在遗传性疾病治疗方面，人们期望通过反义技术进行基因校正或基因再造，弥补先天性缺陷，为反义遗传学谱写新的光辉篇章。

3. 在动植物改良育种方面的应用

反义技术通过基因定向突变，培育出人类所期望的具有特殊功能的物种。例如，反义技术已培育出与苍蝇具有某些相同属性的果蝇；利用抗骨髓基质蛋白的反义核酸培育出神经系统缺陷型鼠，为人类疾病治疗提供了合适的动物模型；向动植物体内引进抗病毒反义核酸表达载体，可产生具有抗病毒感染能力的动植物；抗细胞壁消化酶的反义核酸的导入可为蔬菜和水果的保存和运输带来极大的方便。相信反义技术作为一门新兴的生物技术必将在未来的农业发展中发挥重要的作用。