摘 要
苜蓿、芹菜和花椰菜的体细胞胚（SE）被包装成直径约4 mm的单胚颗粒，即成为人工种子。苜蓿和芹菜人工种子在沙盘和移植块中发育成植株率为7%和10%。本文就人工种子的生产和研究状况进行较全面的报道，它有新颖性。人工种子有广泛而潜在的实用价值。
许多植物如马铃薯、小黄菊和巴斯通蕨等都可用组织培养技术进行无性繁殖而在商业上得到应用。在不需要通过减数分裂和基因重组而产生优良植物后代或杂种的工作中，无性繁殖的手段是很重要的。但是，各种植物从离体培养到温室种植再到大田的适应过程，其技术操作繁杂，要求精确，因而要广泛、大量地进行高效商品化生产，则受到了限制，只能局限于一些产值高的作物。对于用大量种子来繁殖的作物来说，目前的组织培养技术，可以进行高度机械化操作，并直接种植于温室或大田。若这种种植系统与直接用种子种植或移植的耗资差不多，这样成本就不高了。最近8年的研究表明，SE可包装成人工种子。但没有一篇报道说实验已经成功或提出了人工种子生产的具体数据。最近，有一篇关于SE包装于褐藻酸钙颗粒内的人工种子方面的文章，以摘要形式发表。据报道，胡萝卜材料经包装后仍能存活，但不清楚是否有植株的产生，缺少胡萝卜材料包装后所产生植株的数据。另外，很明显难以对单个SE进行包装。看来用聚氧乙二胺作为人工种子的基质，用处不大。
SE包装成的人工种子所以与有性生殖种子类似，基于人工种子与合子型种子的胚在形态、生理、生化方面都相似。它们的胚的发育途径也类似，最终形成具有子叶、并以维管系统相连的胚根和胚芽的结构。在一定条件下，人工种子也具有一般认为仅属于合子型种子的耐严重干燥的能力。此外，在某些种如油菜（Brassica napus）和苜蓿的SE和合子胚一样，可产生一些胚所特有的蛋白质。
SE制成人工种子，直接种到温室或大田，这就需要用一种适应性强、能保护胚又允许其萌发的基质包装，这种基质还要有一定的硬度，才能经受制造、运输和播种的种种考验。基质内还要包含足够的营养、控制生长和发育的物质，以及一些从胚发育到植株所需的化学和生物物质。最理想的，在胶囊中还应含有植物生长的启动微生物和专门适于栽培种植和环境条件的农业化合物。包装过程应适合于单胚胶囊的形成。人工种子应适于现有的种植设备和播种处理，以利于农业上的推广应用。
为了人工种子的商品化生产，必须克服两个障碍：（1）要找出符合上述各种条件的包装基质；（2）获得高质量的SE。所谓高质量的SE，应具备下列特点：在形态学上，SE和合子胚相似，能萌发，具有能发育成有子叶、胚芽和胚根的结构特点的能力；SE可产生与亲本表型相似而有活力的植株。从体细胞胚到植株的发育过程，我们称之为胚的转换，以区别于仅出现根的伸长而未成植株的SE的萌发。后面对于苜蓿和芹菜SE的转换定义还会加以专门的说明。本文，我们讨论了基质筛选和SE质量提高的问题。苜蓿SE随机取样后，其转换率达0.5 ~ 30%，芹菜的SE则从每个培养皿上挑选10 ~ 50个，转换率则稳定在65%左右。
用各种水凝胶，对SE外形成水合胶囊的能力，进行了试验（见表1），其中褐藻酸钠是理想的化合物，因它具有SE包装基质的各种特性。褐藻酸钠在室温（25°C）下可溶解而不需要加热，且与无毒性的二价金属盐如氯化钙的离子可形成凝胶。二价盐使褐藻酸盐聚合物中古洛糖醛酸（guluronic acid）分子上的羧基之间形成离子键而产生复合物，形成褐藻酸钙凝胶。尽管其他二价金属离子盐（如表1）也可与褐藻酸钠形成复合物而具一定硬度（破碎压力为0.5 ~ 2.0公斤/粒）的颗粒，但CaCl2则是SE包装试验中的主要的盐。0.5 ~ 2.0公斤/粒的硬度，可保持颗粒的完整性，在常规操作中不会破损。许多其他基质制成的胶囊颗粒都因不够牢固（有些甚至经不起镊子夹）而不合使用。褐藻酸胶囊外壳强度为1.0公斤或更高时，用Slanhay MKⅡ型带式播种机播种时，并未受到损伤。由于囊粒表面发粘，播种时必须撒上一层滑石粉才行。为了适应大规模播种的需要，要求囊粒外壳更为坚固。
褐藻酸钠用于苜蓿、芹菜和花椰菜的包装是一种非常合适的凝胶。用吸管口（大口的）尖，从褐藻酸钠溶液中吸一个胚，只要把褐藻酸钠中的胚滴入氯化钙溶液中，就可以很方便地制成包含一个SE的褐藻酸钙颗粒。襄粒的大小，由管尖口的内径而定。内径为1.5 ~ 6.5 mm的，即可制得直径为3.5 ~ 5.4 mm的颗粒。一般选用内径为4 mm，制得的颗粒大小为4.6 ~ 5.0 mm。形成完整胶囊粒所需的氯化钙浓度，至少为25 mM，为了确保复合反应的完成，常用50 mM的氯化钙。复合反应的完成至少需要15分钟，但要经过15 ~ 30分钟后胶囊粒方具0.8 ~ 1.2公斤/粒的硬度。由于在30 ~ 60分钟内颗粒再无明显的变化，所以以后的实验中均以30分钟为准。同样，颗粒硬度与褐藻酸盐的浓度及来源相关（见表2），最初用3.2%（W/V）的BDH褐藻酸盐，可得到1.2公斤/粒的硬度。
已发现，其他一些水凝胶也适于用类似方法制作这种囊粒（表1），例如SE用明胶与褐藻酸钾和钠的混合物，或角叉菜胶和槐树豆胶包装，囊粒的硬度达0.8 ~ 2.0公斤/粒。由于这种包装过程相当温和，苜蓿的SE用褐藻酸钙包装成粒与未经包装的对照组，其发芽率一样高（见表3）。所有实验材料中，都只有得到很少数量的再生植株。总的来说，苜蓿胚状体的质量较低，胚的转换率为0.5 ~ 5.0%，凝胶的选择只决定于SE的发芽（根的伸长）情况，因此必须改进SE发生的方法。
角叉菜胶与一种电解质复合，可形成硬度为0.9公斤/粒的囊粒，然而在制作中为了防止过早地形成凝胶，需要加热到45 ~ 60°C，这种温度则会杀死胚状体。在角叉菜胶中加入槐树豆胶则可明显地降低凝结温度，使SE得以存活、发芽并长出植株（见表3）。古阿胶（guar gum）和琼脂都可以形成胶囊粒，但因凝胶温度高和电解质（如四硼酸钠或鞣酸）的使用，胚都被破坏掉，也不能长出植株。黄蓍胶、果胶酸钠和羧甲基纤维素都可形成完整的胶囊粒，但胶囊太软而不能操作（破碎压力小于0.1公斤/粒），只发现在果胶酸钠胶囊中的SE能发芽（表3）。
用瓦尔科（Walker）等报道的胚胎发生方法，对苜蓿进行培养，随机挑选出SE，其大小都在1 mm以上，培养的转换率仅为0.5%。但对于芹菜，则从每个培养皿中挑选SE，可供挑选的SE数非常低，大约每个含500 ~ 1000个胚的培养皿中，只可挑出10个，这种经选择出的SE，其转换率高达65%士6.5。花椰菜SE的包装，仅在早期评估凝胶的作用时做过，后来则因为难以得到大量的胚状体而未继续进行下去，但花椰菜的人工种子萌发率高，与未包装的SE对照实验水平相同，并产生了一些植株。因为苜蓿的转换率太低，所以很难估计SE的包装及其后植株产生过程的效果。可见，包装的效果与苜蓿的SE质量改进提高相关，与芹菜从每个培养皿中可选择出的胚状体数目直接有关。
苜蓿的人工种子先在4°C下放置一周，抑制其萌发，然后再转到1/2 SH培养基上，在24℃下使其萌发，其萌发率与未经放置处理的一样，更长时间的放置处理实验未进行过。所以未进行深入实验，因为很难得到高质量的SE。没有高质量的SE，贮存实验将会限制萌发结果，贮存条件的确切评价主要依据转换串。因此，强调SE的质量改进是十分必要的。另外，在其他用褐藻酸盐包装的种子研究中，我们发现用一种等渗物来抑制种子的萌发，贮存2个月而不受损伤，种到温室中后，胶囊中种子的萌发率；至少可和未包装的种子相等。
在对胚质量改进的研究中，褐藻酸盐所以被选为包装基质的理由是：（1）包装的苜蓿、芹菜、花椰菜的SE能萌发，并形成苗状植株；（2）褐藻酸钠对SE无毒害；（3）褐藻酸盐的凝结特性提供了一种简便的包装方法（例如室温下可溶解于水，在氯化钙中快速凝结和利用悬滴作用即可包装）。
以苜蓿和芹菜为材料，进行了SE质量改进的研究。所以选择它们，是因为相对来说，它们比较容易得到大量的胚状体。以下一些改进方法，可以提高苜蓿SE的转换率。
（1）在脱分化培养基中加入50 mM到100 mM的脯氨酸，保持三周。
（2）严格遵守每20 ~ 23天，将愈伤组织继代培养的制度；每三个月则重新发生愈伤组织系。保持了三个月以上的苜蓿愈伤组织或继代培养间隔时间过长的，都会导致胚状体发生和胚转换的失败。
（3）在整个脱分化阶段中，把脱分化培养基上的愈伤组织中途转移到新鲜培养基上。每次转移后，胚状体变得更大和更成熟了。转换率也由0.5%增高至9.7%（±6.5）。
（4）SE在包装之前经2 ~ 5周的低温（4°C）处理，将SE从培养基上取下；保存在密闭小皿的一滴无菌水里。若不经低温处理，随机选取的SE的转换率仅为5 ~ 7%，经过2周的低温处理：可增加至16%（±6.0），经5周4°C的处理，则提高到23%（±8.5）。
经上述四个方面的处理，随机选取的苜蓿SE的转换率可增至32%（士2.7）。
芹菜SE质量提高是非常困难的，SE的发生很难控制，并对环境变化非常敏感。很明显，对于芹菜来说，首要的问题是提高胚状体的产量。
利用改进的SE发生方法，将以褐藻酸盐包装的苜蓿和芹菜SE放置在1/2 SH培养基上进行萌发和转换，经统计，其完整的苗状植株的再生频率与未包装的对照组相等（见表4）。褐藻酸盐基质不会妨碍胚从胶囊中的出芽，进一步的实验也证实了包装与未包装的SE，其转换率相等（无数据）。我们称苜蓿和芹菜的苗状植株具有下列特点：
（1）一个具有顶端分生组织的芽和两片以上的叶子；
（2）长度为2 cm以上的根，若长度不足，则要有次级的根；
（3）根和芽之间没有愈伤组织，而是直接相连，下胚轴没有过度生长（肿胀）；
（4）具正常表型的绿色植株，畸形的、丛生的、过于矮小的和白化的植株都不属“苗状的”植株。
包装的苜蓿SE直接播种在温室中，再以塑料膜覆盖，以保持高湿度。沙中及胶囊中均不添加蔗糖或其他糖类物质。用瓦尔科和沙托（Sato）的方案时的转换率为0%，而用我们的改进方法时，则增至7%。每个处理试验用100个SE为材料进行蛋白质测定，高质量的SE含有7S和11S的种子贮藏蛋白，而低质量的SE就没有或只有很少。芹菜的人工种子种在泥炭块中，并浇以1/2 SH液体培养基，发现培养基中添加蔗糖，对于实现10%的转换率是重要的，而不加蔗糖，则转换率不到1%（每个处理组用100个SE）。由于加糖而产生污染的问题，显然直接往泥炭或温室混合培养土中加糖是不需要的。但是，早期的实验指出，外源的糖源对于具胚乳类作物（胚乳提供贮藏物质）如芹菜来说，可能是需要的。而无胚乳类作物（子叶提供贮藏物质）如苜蓿就不需要。因此，对胚乳类作物，方法的改进主要考虑营养物质（人工胚乳）如何加到胶囊里面的问题，这样可避免微生物的污染。
人工种子发育成完整植株的能力与SE的质量直接相关。高质量的SE，可在克隆中“忠实”地保持亲本的性状，还具萌发的同步性，且萌发率和真正的种子相差无几。无论是苜蓿还是芹菜，发育不好的SE，其转换率都很低，不管采用何等成熟度和转换的处理办法，结果都是如此。从我们的实验来看，SE发生的每个阶段都会影响到SE的质量，包括愈伤组织的诱导脱分化、产生（胚状体发生）和成熟。没有高质量的SE，无论包装系统如何完好，也得不到苗状植株。由于通常的研究主要集中在SE形成的早期因素或证明能产生一些植株方面，所以有关胚状体发生的文献中，几乎都未提及胚状体的转换率信息。在那些提供萌发数据的例子中，“萌发”（germination）一词也不够确切，到底是指简单的根伸长、根和芽的全部或部分发育，还是完整植株的形成，未明确交代。重要的还是要提高SE的质量，尤其要精确地确定影响SE萌发和转换率方面的因素。最后，SE发生作为一个繁殖系统，我们认为体细胞克隆的差异问题，可能也是提高SE质量的决定性因素。
[Bio/Technology，1986年第4期]