引 言

许多分子技术包括DNA分子的体外操作、克隆和植物转化的应用常被称为遗传工程。这些技术用于将除草剂抗性引入作物是很多商业性农业生物技术实验室认真研究的课题。现有的除草剂对作物和杂草发生共同的作用，除草剂对于与作物相对的杂草的选择性目前基于杂草与作物之间不同的除草剂吸收程度，或者防除的时间选择和施药部位，或者作物对除草剂的解毒作用。如果作物对除草剂具有抗性，那么杂草的化学防除就会更有效，并且可能使作物增产和改善农业操作。看来，对具有短残效期土壤活性的极其高效的除草剂的需求在增长。例如一种叫草甘膦的除草剂，它对动物无毒，能被土壤微生物快速降解，并有效地防除世界上78种最有害的杂草中的76种。因此，如果能够培育出抗草甘膦的作物品种，那么它将得到广泛的应用。

除草剂抗性的遗传变异能自然地发生。例如20多种杂草已经产生抗除草剂莠去津（atrazine）的生物型，几种杂草已形成对百草枯（paraquat）的抗性。另外，利用突变选择技术已经分离出抗磺酰脲类和眯唑啉酮类（imidazolinones）的烟草、玉米和拟南芥（Arabidopsis）植株。经典遗传学已经指出，在很多情况下抗性是由于单个显性基因的突变引起的。因而，抗除草剂特性被认为是植物基因组改造的一个优良选择性状，因为它既具有潜在价值，又可由单个基因所鉴别。植物分子生物学的最新进展和新的基因操作技术的开发能够辅助较多的传统的植物育种方法。

利用分子方法将除草剂抗性成功导入作物的第一步已经朝三个方面着手：1. 目标基因产物的改变，2. 解毒作用机理的增强，3. 基因扩增，部分依赖于独特除草剂的作用机理。本文叙述与除草剂作用方式相关的耐除草剂遗传工程的方法以及通用的克隆技术的合适性。

应当考虑很多因子，与由新的分子技术产生的抗除草剂类型的实际农艺学价值有关，例如除草剂抗性引入后植株活力和产量是否降低，另外，抗性的生理学、生物化学和遗传学知识对于可能出现的问题的恰当估计是必不可少的。格莱塞尔（Gressel）指出，关于培育抗除草剂品种的报道多，谈及它们是否能成功地生产的文章却少。不过，当考虑使用这些选择性的、而在一些情况下勉强安全的、与毒理学和环境忧虑相关的化学品时，由这些技术提供的可能性增加有效选择的数目，这已广泛受到农业化学工业的重视。因此，这是应用植物分子生物学中发展非常迅速的一个领域。

莠去津及其相关的除草剂

这种除草剂的残毒可损害敏感植物，如与玉米轮作的大豆。对玉米施用较少的莠去津可降低对大豆的损害，但杂草的增长却减少玉米产量。玉米的抗性是由于高含量的谷胱甘肽S - 转移酶。谷胱甘肽S - 转移酶类（GSTs）催化谷胱甘肽与多种亲电疏水的化合物结合。这种结合引起这些化合物的解毒作用，进而促使它们从生物组织中排除。业已发现，多种作物（水稻、玉米、小麦、高粱）具有GSTs，使它们对S - 莠去津、乙酰替氯苯胺（chloroacetanilide）和硫代氨基甲酸酯（thiocarbamate）除草剂作用具有抗性，几种GST蛋白已经从玉米中分离。它们分别命名为GSTsⅠ、Ⅱ和Ⅲ，玉米GSTⅢ已经克隆，并能在大肠杆菌中表达。这个问题的一种可能的途径是用一个编码GST的玉米基因转化大豆，从而使大豆也产生高含量的该种酶。然而，与多种作物相比，玉米另外含有大量的谷胱甘肽，要通过大豆获得莠去津抗性就会需要大量的GST和谷胱甘肽。

莠去津类化合物通过干扰光系统Ⅱ中光合电子传递而杀死植物。已知它们干扰质体醍结合于QB蛋白上。QB蛋白是疏水的，嵌于叶绿体的类囊体膜中。它由第32光基因（叶绿体基因组中的一个基因）编码，很多种植物和微生物的抗莠去津类型是自发形成的。植物中产生的QB蛋白不同于由单个氨基酸替换的野生型蛋白，且不能与除草剂结合。这个基因对通过活体外重组DNA技术的操作是一个潜在的优良材料，如果QB结合位点的结构能在遗传上修改以改变它对于相近除草剂的敏感性，那么就会开发出更有效和更专一的除草剂。不过这个特性将是母系遗传的，因为它由一个叶绿体基因编码。因此，需要能够将外源基因整入叶绿体基因组的转化技术。

事实上德 · 伯劳克（De Block）等报道，经过土壤根癌杆菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti质粒的叶绿体转化已用于从处理的原生质体再生烟草植株。在这项研究中发现，一转基因植株的氯霉素抗性归因于细菌产生氯霉素乙酰转移酶。这种抗性相当不稳定。进行杂交后发现，该特性是母系遗传的，表明引入的基因存在于一细胞器基因组中，进一步证实该基因位于纯化的叶绿体内。叶绿体转化很可能是一项难以发展为常规工序的技术，部分地由于细胞中存在很多份叶绿体基因组拷贝。Cheung等采用的一个可选择方法是将叶绿体基因转变为核基因。Cheung及其同事从小苋｛Amaranthus hybridus）的抗莠去津生物型分离出编码QB蛋白的基因。该基因的编码区段与编码核酮糖二磷酸羧化酶（RuBISco）的小亚基的核基因转运序列相接。这个转运序列指令通常负责将RuBISco小亚基分子转入叶绿体的多肽链结构。在用含有重组基因的根癌杆菌Ti载体转化而成的转基因烟草植株中发现，苋QB蛋白定位于叶绿体的光合膜。此外，这些转基因植株表现出莠去津耐性，而对照组烟草植株则不耐莠去津。

因为这类莠去津抗性由一个叶绿体基因编码，所以有人试图将“外源叶绿体”导入感性植物。茄属龙葵（Solanum nigrum｝抗秀去津而马铃薯（S. tuberosum）不抗。通过辐射龙葵的原生质体，将它们与马铃薯原生质体融合，有可能再生出一种具有龙葵和马铃薯质体但只有马铃薯核基因组的杂种（原生质体辐射阻止核分裂）。这样的杂种的混合叶绿体种群并不稳定，还可观察到亲本叶绿体基因组被排除的现象。因此，利用原生质体融合能引起品系之间叶绿体类型的快速改换。Barsby等证明，具有重要农艺性状如抗莠去津的甘蓝型油菜brassica napus）杂种能有效地获得，足够使原生质体融合成为一项有用技术。然而，再生植株虽然有抗性，但尚未检定品质和产量。为了让这项技术应用于其他作物，必须建立从原生质体再生植株的体系。从油菜属研究清楚看到，从不同的种导入完整的叶绿体基因组可对产量有较大的影响。通过有性杂交，已将母系遗传的莠去津抗性从白菜型油菜（B. campestris）导入甘蓝型油菜。

磺酰脲类（Sulphonylureas）

与基因扩增或改变调节相比较，结构基因突变被认为是遗传工程稳定抗性作物的更好方法。磺酰脲类抑制乙酰乳酸合酶（ALS），该酶催化植物中支链氨基酸生物合成的共同的第一步。查尔夫（R. Chalff）及其同事，通过将突变细菌ALS基因转移到烟草中，已使这些烟草植株产生对磺酰脲除草剂、氯磺隆（chlorsulfuron）和Sulfometuron methyl的抗性。抗性植株能经受除草剂的浓度比通常田间有效地防除、杂草所施用的剂量大30倍左右。

郝恩（Haughn）等研究了突变使拟南芥产生磺酰脲抗性，他们能证明抗性植株产生改变的乙酰乳酸合酶。接着，利用拟南芥ALS基因和以前克隆的酵母菌ALS基因之间的同源性来克隆正常的和突变的编码拟南芥ALS的等位基因。已证明两个等位基因的一个碱基对不同，这导致在ALS的抗性植株中脯氨酸被丝氨酸所取代。用根癌杆菌Ti质粒转化系统产生了含有拟南芥突变的ALS基因的转基因烟草植株。已经表明，这样的植株及其后代的组织对氯磺隆的抗性强10 ~ 100倍。

草甘膦｛Glyphosate）

草甘膦通过抑制5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸酯（EPSP）合酶而起作用，这种酶催化磷酸烯醇丙酮酸和莽草酸－3－磷酸酯形成EPSP。这使芳香氨基酸缺乏、莽草酸积累，导致细胞死亡。草甘膦耐性可以三种方式产生：由于一种不受除草剂抑制的改变酶的生产，由于这种酶的大量生成，或者通过将一种特定使除草剂活性成分失活的酶引入植物。关于前两种方式已经报道，第三种至今没有得到可用的结果。

Comai及其合作者利用一个突变的aroA位点的等位基因的表达，已经操作草甘膦耐性进入烟草，该基因编码鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella tymphimurium）的EPSE合酶。这种突变的等位基因引起一个氨基酸替换（脯氨酸由丝氨酸取代），导致该酶对草甘酶的亲和力降低。将该突变编码序列从一个Ti质粒opine合酶基因连接于转录信号以获取这种细菌基因在植物中的表达。从用含有重组的Ti质粒的土壤根癌杆菌处理过的叶圆片产生了转基因烟草植株，后来验证了细菌EPSP合酶的存在。虽然EPSP合酶的含量在不同植株中不同，但与对照组植株相比，它们的草甘膦耐性都强。最近Fillati等报道，利用改良的外植体组织土壤杆菌转化系统，获得aroA基因进入番茄植株的稳定整合和表达。aroA纯植株的后代是耐草甘膦的，且耐性表型的分离方式与孟德尔遗传相符。然而转化植株的温室试验表明，与对照组未喷洒的植株相比，喷洒草甘膦后生长有一些降低。这说明草甘膦抗性的水平可能不是足够高达商品化应用。

业已证明，芳香氨基酸的生物合成发生于植物的分离的叶绿体中，莽草酸途径酶也已在叶绿体中发现细菌aroA基因缺乏叶绿体转运呔序列，因此引起该酶的一种细胞质类型。从碧冬茄（Petunia hybrida）的耐草甘膦的悬浮培养细胞系的EPSP合酶的完整cDNA克隆序列分析表明，该酶是先合成具有72个氨基酸的转运多肽序列的前身多肽。这个氨基末端序列负责将前身酶在转译后修饰时引导进入叶绿体。前身多肽和成熟蛋白质都有酶活性，都受草甘膦抑制。在已经用一细菌基因转化的转基因烟草植株中，将合成EPSP合酶而没有氨基末端转运肽，因而该酶不会进入叶绿体。有趣的是，这种酶的细胞质类型能使植物仍产生草甘膦抗性。因此我们可以推测，如果将这突变酶输送到叶绿体中，那么耐性可能显著增强。

Della-Cioppa及其合作者已成功地证明，将抗草甘膦的大肠杆菌EPSP合酶连接于相应植物酶的转运肽序列的后面，能使之输送到叶绿体中。为将这个抗性基因引入植物，他们构建了一个含有重组的植物/细菌的前－EPSP合酶cDNA的质粒，由该质粒编码的嵌合前酶包含72个氨基酸的氨基末端转运呔，而前面27个氨基酸来自碧冬茄EPSP合酶成熟酶。在该植物酶序列的第28至53个氨基酸位置接上野生型大肠杆菌的EPSP合酶，第54至427个氨基酸位置接上大肠杆菌抗草甘膦的突变的EPSP合酶。为了检测来自碧冬茄酶的转运肽能否把细菌EPSP合酶导向叶绿体，将莴苣（Lactuca sativa）的完整叶绿体与86S - 蛋氨酸标记的质粒基因的转译产物一起培养，结果，嵌合酶输入叶绿体的效率与未经改造的植物酶的输入效率几近相同，这种嵌合酶在叶绿体内经蛋白质水解过程，产生了催化活性，并抗除草剂。

膦蓖麻碱（Phosphinothricin）

另一个较早期提出作为植物抗除草剂的基础的基因扩增的例子，由道翁（G. Dorm）等报道。它们分离出一个苜蓿组织培养细胞系，可抗非选择性除草剂L - 膦蓖麻碱（PPT）［是谷氨酸合成酶（GS）的一种竞争性抑制剂］。GS是植物氨的同化和氮素代谢调节中的一种重要酶。他们发现这个具抗性的系含有高10倍的GS活性，而这种增加是与GS专一的RNA和DNA水平一致的。他们认为，增加的酶蛋白和酶活性，即使在抑制剂存在的情况下，仍有足够的酶活性可供使用。同样，用一个强的植物启动子，也能使GS基因大量表达，而引起酶活性增强。然而，将大量的谷氨酸酯转变为谷氨酸，可能对植物的氮素代谢产生不利影响。

从观察中得知，如果将膦蓖麻碱乙酰化，那么它不再抑制GS. Thompson等从一种链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）分离、克隆了bar基因、并分析了其性状。该链霉菌能产生一种次生代谢物bialaphos（一种含有PPT的三肽）。bar基因编码膦蓖麻碱乙酰转移酶（PAT），将PPT转变成无毒的乙酰化状态，使链霉菌对bialaphos具抗性。在原生质体共同培养和叶圆片感染实验中，利用根癌杆菌载体，已将这个bar基因转移到植物细胞，并利用花椰菜花叶病毒86S启动子以及章鱼碱T-DNA第7基因的末端与多腺苷酸信号，bar基因在烟草、马铃薯和番茄植株中表达出来。然后在含有卡那霉素或不同浓度的PPT培养基中筛选转化植株。发现0.5毫克/升PPT就足以抑制敏感细胞的生长，而转基因愈伤组织则可在含有500毫克/升PPT的培养基中生长。转基因烟草品种Patit Havana SR1植株栽培在温室中，生长正常。给对照组植株和转基因植株喷施相当于8升/公顷和20升/公顷等剂量的Basta（R）和Herbiae（R）（分别为PPT和bialaphos的商品剂型），转基因植株表达出不同含量的PAT，并全部抗这些除草剂。2升/公顷Basta（R）即有效地杀死对照组的烟草植株。

结 语

研究各别除草剂的作用方式会找到有用的抗性基因，利用遗传工程操作，培育抗性作物，并为新除草剂的合理设计提供分子学基础。该领域未来前景尚有赖于更多种作物的有效转化技术和再生系统的发展。用遗传工程操作除草剂抗性的方法因除草剂以及作物种类不同而必定不同，但是，这项技术提供了创造出环境上安全、有效、广谱、可遗传的抗除草剂的优良品种的可能性。遗传工程是一项强有力的新技术，许多生物（包括细菌、动物和真菌）的基因库将都可用于作物改良，对今后十年的农业会产生更大的影响。

[Euphytica，Netherlands Journal of Plant Breeding，1939年第40卷第1 ~ 2期］