尽管人类在植物遗传工程上作出了相当大的努力，并在某些种类中已取得了显著成就，但世界上主要的禾谷类作物仍证明很难进行遗传转化。本文对各种已使用过的方法作一评述，并评价了何种方法可用作禾谷类的常规转化方法。表谷类的生物学特性也许是未来走向成功的关键。

土壤根瘤农杆菌能转移遗传物质至植物中的机理的发现，使人们将其利用于遗传分析和植物遗传工程中成为可能。很快开发出一项技术。如外源基因的转化和整合、肿瘤诱发基因的鉴定和失活，产生出了转基因植物。双向载体系统的构建，受体植物组织的优化以及选择性标记基因的开发产生了将基因转移至植物的有效、可重复和广泛应用的实验系统。

然而，由农杆菌开发的机制并不是在所有植物中同等地发生作用。当这一技术明显地难以用于大多数作物，特别是禾谷类时，产生了一些严重问题。直至最近，人们认为禾谷类和农杆菌不能相互作用，这样也就没有DNA转移。尽管精细的实验表明农杆菌或许能调节DNA转移至禾谷类细胞中，但从用遗传工程农杆菌处理的禾谷类组织的大多数尝试中仍未产生转基因禾谷类植物。现已清楚这些失败基于不易回避的生物学基础。农杆菌基因转移的机制需要植物细胞处于特定的易感态。这种状态产生于邻近作为“受伤反应”部位的受伤组织的细胞，“受伤反应”的特征之一是分化细胞的脱分化。分化的禾谷类细胞表现出缺乏受伤反应和脱分化能力。即使DNA能转移至受伤邻近细胞并能整合，但因受伤邻近细胞不能增殖也不会产生转基因细胞克隆。禾谷类分生组织中难增殖细胞要么难以感染，要么不易转化。那么什么是取代表杆菌对禾谷类进行遗传操作的稳定基因转移方法呢？

原生质体再生

有些植物能从缺乏细胞壁的单个细胞，即原生质体再生。原生质体仅仅被一层简单的原生质膜包被，DNA能直接用简单的物理处理方法导入。仅在这一技术可用的几年间，通过对细胞的电穿孔或简单化学处理导入DNA，已有效地利用原生质体产生出转基因植物。导入的基因能以孟德尔方式遗传，其稳定性可与其他植物基因比拟。这种直接基因转移也能有效地进行共转化，并产生了首例转基因植物。如何将此方法用于禾谷类呢？这些技术早期曾用于禾谷类原生质体的转化，但离转基因禾谷类的再生已过去了几年的时间。然而这似乎并不能解决问题。

禾谷类原生质体的再生是一个非常精细而通常又是不可靠的过程，取决于不能实验控制的许多因素。虽然这是迄今已产生出转基因禾谷类的唯一方法，但仍难以想象这一技术能在短期或更长时期内发展成任何植物常规基因转移的基础。 大量的其他途径，有些已显示出很大的潜力，仍需考虑。

生物弹击法

目前人们对粒子枪法或生物弹击法有着浓厚的兴趣。一些研究者相信此法能用于实际上从任何物种或品种产生转基因植物。此法通过将粘附于重的颗粒上的DNA射击到植物组织而带入所有的生物复合物。在洋葱细胞中，首先尝试了此方法，证明标记基因瞬时表达。在茎分生组织经生物弹击处理后，在一种重要的农作物，大豆中获得了转基因植物的再生。自此，众多的实验室在大量的实验中使用弹击仪，发现这一技术并非像希望的那样有效。事实上，似乎相当不理想，至少对于整合性转化效果甚差。

那么，此法对禾谷类的应用可能性如何呢？令人吃惊的是，用生物弹击法处理还没有产生出转基因禾谷类植物的报道。但在最近的一些会议，如加州大学洛杉矶分校1989年植物基因转移会议上报道了一些有潜力的发现，特别是关于叶的转基因部位。鉴别出为什么生物弹击法效果不佳，特别是为何仍未产生出转基因禾谷类植物的原因是可能的。我们可以看出生物弹击法几个内在的弱点将是实验难以解决的：

整合转化的频率取决于转移基因的浓度；如果这—浓度低于一相对高值，转化频率接近于零。在一个粒子上转移足够量的DNA是困难的，或者是DNA从粒子上释放出来太慢。

转基因植物的再生需要外源基因转运，并整合到对整合性转化和克隆增殖与再生易感的细胞的DNA中。这种细胞在禾谷类植物中极为稀少；而且显然难以从幼苗、茎分生组织、不成熟盾片、体细胞胚和胚性悬浮培养物获得，所有这些组织均已在生物弹击法中用过。

即使有时能成功地在多细胞结构中一个细胞的整合性转化能产生转基因嵌合体。如果不易获得次级形态发生和转基因细胞的选择，如禾谷类中一样，这对于转基因部位种系的维持是极为幸运的，然而禾谷类的发育模式不利于转基因部位生长成花分生组织。

此法仍有问题，但报偿亦很大。现在生物弹击法投入的大量人力物力使目标终将达到的乐观者有些退却。但我不相信我们已接近一种有效的常规技术。

显微注射

显微注射是很早以前看来很有希望的另一项技术，但仍出现了一些未预料的问题。三年前，标记基因通过显微注射到微孢子长成的油菜原胚产生出转基因嵌合体。自那以后，我们试图在禾谷类中获得成功，并将此技术扩展到合子原胚中。我们考虑了关于重要禾谷类农作物足够的微孢发生的原胚的产生与分离，以及非常幼嫩的合子原胚的植株再生中的关键问题。两类问题已解决（部分要感谢哥本哈根卡尔伯格实验室和北京中科院遗传所的合作）；几百个微孢发生和合子原胚的玉米、小麦、水稻和大麦已显微注射并已再生成植株。数千个有性子代分析了外源标记基因的存在：我们还未发现其存在。那么，什么是这一方法的症结呢？

当然，与生物弹击法相同的一个问题是禾谷类的发育模式使可能的转基因部位限制为一个或几个植物繁殖单位。不能形成花端分生组织的转基因组织最终会丢失，因为从分化的禾谷类组织再生成植株是困难的。但更为严重的问题可能是禾谷类的原胚和分生组织不含有许多整合性转化易感细胞。事实上，用农杆菌、生物弹击法和显微注射进行的所有实验的一种解释是，禾谷类基因转移的关键问题并不太在于DNA转移方法，而更取决于易感细胞的可用性，或许原生质体较之其它方法更为有利：原生质体的分离也许能使潜在易感细胞转变成易感性细胞。

其它途径

以上讨论的四种方法均不能开发出常规的可用的基因转移法，并且均有其固有问题。还有其它数种方法，虽不能保证对非禾谷类系统进行整合性转化，仍值得讨论。这些方法不仅试图进行整合性转化，而且取决于自身复制分子的体内扩散。

花粉转化   70年代早期，用实验试验了花粉能否作为转移外源基因至有性子代的运载工具。自那以后，数家实验室利用复杂的分子技术进行了实验。子代中获得了数种有趣的表型，Southern分析所获的一些数据可供利用。另外，有经验的研究者进行的大量实验产生明显的负结果。如果将萌发的花粉培育于DMA溶液中转化合子有可能，这也许是一种理想的方法。但十五年不断改进实验的无数次不能产生证实的转基因子代的失败表明，使花粉转化发展成有效的转化法的机会是很小的。

花粉管通道   通过从花柱向下生长的花粉管接近胚囊发生时的卵细胞。这些花粉管能用作DNA转移至合子吗？在水稻受粉几小时后，标记基因溶液施用于切开的花柱产生了卡那霉素抗性子代（不可靠的标记——可能产生假阳性），不幸的是，Southern分析的数据不足以证明为整合性转化。再者，如果能成功，这可能是一种理想的方法。但实验似乎难以重复。几个生物学障碍，如花粉管中胼胝质阻塞、核酸酶、细胞壁吸附、助细胞、DNA转运等似乎使这一方法不是很有前途。

组织培育   自从1965年以来，研究者试图简单地将种子和组织培育于DNA溶液中而转移基因至植物中。难以想象这怎能发生，因为植物细胞壁对一个功能性基因或更大的DNA分子是一个足够的屏障或陷阱。最近的实验用从盾叶期的谷子分离的干禾谷类胚，这样产生大量受伤部位。这些胚培育于病毒或非病毒DNA中有证据表明标记基因的瞬时表达和病毒DNA的重组。希望这些胚的植株再生能产生转基因禾谷植物，并且在研究其大量的子代。至今仍未证明整合性转化，并且产生转基因禾谷类的机会极小：病毒DNA也许能在体内扩散，但不能整合，非病毒DNA最终没有机会到达将能再生枝的易感细胞。至多非病毒DNA将到达某些伤口邻近细胞，而这些细胞不能增殖。

然而，发现能获得病毒DNA整合的方法，还有其它正在开发的导入DNA的途径。

农杆菌感染   根癌农杆菌的DNA转移机制也能用于转移病毒染色体组至植物中，而这是机械促进的病毒感染所不能起作用的。病毒然后在植物体内扩散。事实上，这是一种放大单个DNA转移的方法。这种方法已用于运载DNA至禾谷类中；农杆菌感染后，玉米DNA病毒在玉米中的扩散表明是行得通的。真的，后来证明在双子叶和单子叶植物中没有很大差异。这一方法中所用农杆菌是一种禾谷类遗传工程的可行载体系统吗？不幸的是，现在这看来是不可能的。一个携带有外源基因的病毒能在农杆菌感染的植物中将基因散布开。但病毒不能为分生组织接纳，这样阻止了将基因转入子代。病毒不能整合到宿主染色体组中，这样，基因就不可能整合至种系细胞的染色体组或极少的转化和再生易感细胞之中。外源基因整合的唯一机会是既不易感又不能增殖的伤口邻近细胞。

DNA和RNA病毒载体   花椰菜花叶病毒中非必需病毒区域用选择性标记基因取代能用于在病毒感染时，产生含有和表达标记基因的芜菁。现希望此原理能扩展到其它（多拷贝）基因和其它病毒。然而一个问题是病毒染色体组中只有很少的非必需DNA，这样它们不易承受额外的遗传物质，更多类的植物RNA病毒也许能提供更广阔的机会，虽然同样难以设想在发现能使病毒染色体组整合至植物DNA的条件前，病毒载体怎会对产生转基因植物很有用。

微激光  能将光聚集于显微镜光路的紫外线微激光仪已用于将细胞壁“烧”出孔。在ONA溶液中的细胞的质壁分离复原已用于增加DNA通过这些孔的吸入。现已有些基于荧光标记和抗体选择的转化的未定论证据。但目前微激光技术也许对困难物种转基因植物的建立的作用不大。

电泳   放射活性标记的标志基因溶液已用于通过大麦种子茎分生组织进行电泳。用放射自显影表明标记物沿细胞壁运动。因降解产物而使细胞壁标记的可能不能排除。如果DNA真的在细胞壁上运行如此长距离，也许能通过细胞壁进行运输。这可能是一个重要的发现。

大量注射   有时有理由希望通过六的注射针注射大量DNA至禾谷类的花端分生组织会产生转基因子代。Southern分析、酶数据和所需表型的遗传的证据看来非常有前途。不幸的是，尽管作了巨大努力，没有人能改进这一技术。那么以此为一种有效的方法似乎是不可能的。同样也难设想注射的DNA将怎么到达产孢组织，因为这将不得不通过一系列的细胞壁。

电穿孔   通过含有原生质体和DNA溶液的小室的电容器的放电是一种常规的DNA吸收和瞬态以及稳定的整合转化法。当用于不同细胞和组织时，结果似乎确信细胞壁是对功能基因大小的DNA分子的有效屏障。

脂质体融合  含有DNA的脂质体能与原生质体融合，这样能转移基因，经过处理后能获得转基因植物。然后，当用细胞、组织而不是原生质体时，脂质体处理不能突破细胞壁屏障。一种有趣的修改是将显微注射与脂质体相结合，将分化植物细胞的中央大液泡的不利因素变成有利因素：注射进液泡的脂质体与液泡膜相融合，并释放内含物至胞质中。但至今未获得转基因组织。

展 望

用根癌农杆菌对具有受伤反应的植物，以及用直接基因转移对能从原生质体再生植株的种类（现约150种）是常规和有效的植物基因转移方法，转基因禾谷类（水稻、玉米）已获得，但仅只是原生质体直接基因转移的结果。这种方法不能用于任何指定的植物种类。因此，开发一种获得禾谷类和其它重要作物或任何指定的植物种类和品种的常规基因转移方法是一项挑战。生物弹击和显微注射至合子原胚似乎是最有前途的方法。其它方法也有些潜力。研究的关键领域是：（a）分生（胚性）组织中易感细胞的频率显然太低，（b）生物弹击法和微注射法整合转化频率低，（c）植物胚和茎端分生组织的发育模式。

[Trends in Biotechnology，1989年第7卷第10期]