凝集素是以高亲和性将聚糖结合在糖蛋白、糖脂或多糖上的碳水化合蛋白，由于具有结合的特异性，凝集素能在细胞内、细胞间或组织间作识别分子。许多不同的植物种类、不同的器官、组织中都发现有凝集素的存在，因此，猜测它在植物中起着很基本的生物学作用。

在已定性的植物凝集素中大多数是分泌蛋白，它们先进入分泌系统，然后在液泡或细胞壁和胞内空间中积聚。如为人熟知的植物血球凝集素（phytohema-gglutinin，简称PHA）、伴刀豆球蛋白A、大豆凝集素、豌豆凝集素和蚕豆溶血素都以相对高的浓度出现，并在子叶的液泡中累积（占总蛋白的1%—8%），或以低浓度在种子的胚轴中出现，这些凝集素在种子发育中伴随着大量的种子贮藏产生，成苗过程中，又都分解产生苗需要的氨基酸。凝集素在农作物的根、叶、根状茎和茎中也很丰富，有的存在于液泡，有的则在细胞外（如曼陀罗属植物种子中有几丁质结合的凝集素）。谷类种子中的液泡凝集素含量较少（1 μg/干种子），且仅存在于胚的特定细胞层次，如小麦胚的胚根鞘和根冠中的小麦种子凝抗体。

植物凝集素家族中的基因和蛋白质

菜豆中含有PHA种已被完全定性的丰富的凝集素和促细胞分裂剂，这种四聚体凝集素是由多肽PHA-E和PHA-L不同结合的五种同型体组成，PHA-E的四聚体（Mr=34，000）能凝集红细胞，而PHA-L的四聚体则能凝集白细胞，并有促细胞分裂活性。混和两种多肽的四聚体能结合两类血细胞。PHA-E和PHA-L都识别哺乳类糖蛋白的多聚糖末端半乳糖残基。PHA-E和PHA-L多肽分别由dlec1和dlec2两个串联基因编码，这些核苷酸水平90%同源的基因，所编码的蛋白有82%的氨基酸顺序相同，蛋白的生物合成、翻译后修饰和向液泡转运的过程都已有相当细致的研究。

在霍夫受（Hoffman）和唐纳德森（Donaldson）（1985）报道得到PHA-E、PHA-L的氨基酸顺序之前几年，这个组已分离了编码一个27 kD“凝集素类似的”蛋白的cDNA，所得到的氨基酸顺序中的两个Met残基的出现表明，这段cDNA并不编码PHA，因为已提纯的PHA的所有氨基酸分析都表明完全没有Met残基，这个“凝集素类似”蛋白在糙面内质网上合成、糖基化，后转运到贮藏蛋白的液泡中，经水解形成Mr15，000—18，000的多状。我们（M. J. C）实验室的工作显示这个蛋白与豆子中一种已被定性的淀粉酶阻遏物相同。我们将霍夫曼等（1982）从转入种子特异性启动子的转基因烟草中获得的cDNA进行表达，得到有αAI蛋白及活力的烟草种子蛋白，由于这个基因编码豆类αAI，"我们定名为αai。αai基因的密码顺序有82%与编码PHA的基因dlec1和dlec2同源，得到的基因组克隆已表明了αai、dlec1、dlec2的物理相关，这样，αai就很可能是产生于一个先祖的凝集素基因的复制和分离。我们并不知道αAI是不是凝集素，但看来不像，因为αAI和PHA-E、PHA-L的氨基酸顺序比较表明：PHA的一个重要的糖链连接区在αAI中不存在。必须注意豆类αAI除了其生物学活性，与谷类中的αAI是完全不相近的。

奥斯本（Osborn）及其同事们在检查一个丰富出现于菜豆墨西哥变种中的蛋白时，发现了植物凝集素家族的另一个多肽，这种豆类能抵抗两种摄食作物的豆象（巴西豆象Zabrotes subfasciatus和菜豆象Acanthoscelids obtectus），这经野生抗性变种都具有敏感变种所没有的arcelin蛋白。

arcelin-1（四个电泳变型之一）的cDNA克隆显示核苷酸顺序与PHA有78%相似性，由cDNA得到的氨基酸顺序与PHA-E、PHA-L及αAI有58%—61%的同一性。遗传学证据表明这些野生变种中的arcelin基因与PHA基因有密切联系。有趣的是，PHA在90%的栽培豆类和野生变种中出现，而rcelin在栽培豆类中没有而仅存在于10第的野生变种中，表现出所有驯化品系均由无rcelin的野生品系而来，或野生品系原本就没有arcelin，再或是arcelin基因在驯化过程中丢失或失活了。

植物凝集素家族中蛋白的防御性质

长期以来，人们知道许多动物生吃菜豆会中毒。饲喂实验证明，纯化PHA对哺乳动物和鸟类也是有毒的，几个小组称PHA会结合于大鼠肠粘膜，反映在表面的损害、破裂和微绒毛的不正常发育。PHA加入实验动物饲料，阻止了肠壁对营养物的吸收，并且极大地增加了细菌在小肠内繁殖。简曾（Janzen）等（1976）首先猜测PHA对昆虫特别是豆象类甲虫有毒，之后为盖特豪斯（Gatehouse）等（1984）所证实。两者都发现“纯化”PHA对四纹豆象（Callosobruchus maculatus）幼虫的发育有阻碍，但盖特豪斯等得到的结果显示非纯化PHA比纯化PHA妨碍幼虫发育更有效，非纯化PHA制品由Mr15，000—18，000的大范围的多肽得到，很可能有αAI的存在。新的结果显示精细纯化的PHA对四纹豆象无毒，而且盖特豪斯等使用的低纯化制品确有αAI存在，这对豆象有相当毒性。

arcelin作为野生豆类中的PHA类似物，对巴西豆象是有毒的。调查者们做了一批arcelin⁺野生豆和arcelin^-栽培豆的杂交种，以求显示无Arc基因、单Arc拷贝或双Arc拷贝对于种子中豆象成虫出现率之间的剂量无关。结果，arc/arc基因型中93%的幼虫发育成为成虫；Arc/arc基因型中降至20%一40%；Arc/Arc基因型则为2%。在人工种子的饲喂实验中，混和10%（W/W）arcelin使巴西豆象的成虫出现率由76%降至18%，低水平的arcelin5%（W/W）则无效果。虽然使用的arcelin制品仍可能混有αAI，就像前述PHA混合αAI一样，但是豆类的αAI对巴西豆象中肠的α - 淀粉酶的阻遏是较弱的。这样，arcelin中混有αAI就不能作为arcelin阻碍幼虫发育的解释。

PHA家族中第四个蛋白αAI是一种哺乳类和昆虫α - 淀粉酶强有力的阻遏物，当时昆虫饲喂实验时，0.2%（W/W）的量已足够阻碍四纹豆象幼虫的发育，αAI为0.8%时幼虫有100%的死亡率。

为植物凝集素家族蛋白（PHA-E、PHA-L、αAI和arcelin）编码的基因都互有联系，这些同族基因很可能是由一个先祖基因在复制和分离过程中产生的，这就使不同的蛋白分子获得不同的植物防御性质。（表1）

含几丁质链的蛋白家族

一些禾本科种类的种子中含有凝集素，特别是连接有蔗糖N - 乙酰葡糖氨（GlcNAc）、GlcNAc寡聚体和几丁质 - GlcNAc残基的多聚物。五倍体小麦中，带有GlcNAc链的凝集素WGA包括三个独立的同型凝集素单体（A、B和D），由不同两倍体基因组中的同族基因编码。cDNA克隆表达得到的同型凝集素ABD，在氨基酸和核苷酸水平都有93%到95%同一性。

凝集素与WGA在免疫和生化上很相似，除小麦外，还出现在黑麦、大麦、水稻、茅草和短柄草中，从我们（N. V. R）实验室的工作看，cDNA克隆编码的大麦凝集素、水稻凝集素同WGA也是同系的，氨基酸顺序相似性分别为：大麦凝集素~WGA-B95%；水稻凝集素~WGA-A78%。而水稻凝集素~WGA-B/WGA-D之间分别只有44%和33%。这表明它们在进化过程中有相当的分离。

禾本科凝集素产生时是前蛋白原的形式，它的疏水信号肽在翻译后切除，肽原的碳末端修饰接上一个高甘露聚糖。多肽在液泡中积累前先经过高尔基复合体，在运输期间或到达液泡后，碳末端糖基化的肽原从蛋白分子上解离下来生成成熟凝集素。最近，我们实验室发现碳末端肽原是凝集素正确地分类运到液泡所必需的。WGA和大麦凝集素都是36 kD的二聚体，由相同的两个18 kD的亚单位构成，在栽培水稻种类中，大多数18 KD亚单位可以进一步水解为8 kD和10 kD亚单位，已研究的所有禾本科凝集素的成熟蛋白分子都包含四个43氨基酸的同源区。氨基酸顺序比较表明WGA的四个区域有49%—67%的相似性，大麦凝集素的四个区域有48%—72%的相似性，说明这些基因由同一区域复制而来，称为hevein区，因为它与橡胶树（Heveabrasiliensis）乳汁中发现的一个小几丁质链蛋白hevein（橡胶蛋白）有大约50%的同一性。（图1）

最近（1990），我们的实验表明编码hevein的cDNA克隆比编码一个43氨基酸的蛋白所需的核苷酸虫段大得多（图2）。hevein的cDNA编码一个信号顺序和一个末端附有144氨基酸肽段的hevein区。由纯化hevein和cDNA表达产物之间的肽段长度差异，可以假定hevein是由前蛋白原经水解形成的，后者与两种马铃薯损伤诱导基因产生的蛋白有65%—68%同一性。值得注意的是豆类、烟草、白杨和马铃薯的基本几丁质酶及薏苡（禾本科）中的一个双功能蛋白（αAI）具有很相似的基因结构。

在刺荨麻的地下茎中，存在着几丁质链区结构的蛋白家族的另一成员，即UDA（Urtica dioica 2gglutinin异株荨麻凝集素）。它对GlcNAc寡聚体有高度专一性，它的cDNA编码的蛋白比预想的大得多。

其他几种从西红柿、白屈菜、曼陀罗以马铃薯中分离而来的几丁质链凝集素，具有和hevein、WGA相似的氨基酸外形（甘氨酸、半胱氨酸含量高）。马铃薯和曼陀罗凝集素还具有一个非相关的羟脯氨酸丰富区。

虽然以上四种凝集素的基因还未能分离出来，但最近已从马铃薯和白杨中克隆了hevein、UDA、基本几丁质酶cDNA和损伤诱导基因，使“几丁质链区域是许多蛋白质的建筑块”这一事实较为清楚了（图2），所有这些蛋白质都具有相似的糖链结合专一性。由于共同区域的出现，可以提出：通过几丁质区与非相关区（hevein、几丁质酶等）的基因融合、复制，演化产生了这些蛋白质。看来带有几丁质区和其他结构区的另一些组合物也将不久在其他植物中发现。

具几丁质连接区蛋白的植物防御特性

所有连接有几丁质的蛋白都能影响含几丁质的有机体（真菌和昆虫）的成长。禾本科凝集素虽然量较少，但在胚胎和籽苗组织的专一细胞层次中（如：胚根、胚根鞘、胚芽鞘、盾片、根尖）却有相对高的富集。在胚萌发和苗成长过程中，有些组织与环境建立直接联系，因而之中凝集素的专一性富集很久以来都作为抵抗真菌侵染的证据，早在1975年Mirelman等就猜测WGA能作用于苗对真菌攻击的抵御过程，他们曾观察到WGA阻止了孢子萌发在绿色木霉（Trichoderma viride）菌丝的生长，后为其他研究者证明，但也有不同意见，如：观察到的效应应该归于WGA本身，还是因为用几丁质亲和层析制得的WGA中混合几丁质酶？Schlumbaum等证实在体外，WGA的去几丁质酶制剂并不阻碍其菌生长，而几丁质_则确实阻碍了其菌的生长，（表1）

Murdock等（1990）证实，使用一个人工种子系统，1%（W/W）WGA能使四纹豆象幼虫的发育时间由32天延长至55天，且WGA的三个同型凝集素具有相近的效应。Huesing等（1991）用水稻凝集素和UDA也得到了相似的结果。可见纯化的曼陀罗凝集

素和西红柿凝集素却对发育中的四纹豆象幼虫效应甚少。最近，体外实验证明WGA对两种重要的玉米害虫——欧洲谷类蛙虫（Ostrinia nubilalis）和南方谷类根际昆虫Diabrotica undecimpunctata）的发育有阻碍效应，人工饲料中0.059%（W/W）WGA对欧洲谷类蛙虫有50%致死率，0.3%（W/W）WGA可使南方谷类根际昆虫的体重有汉）寃的下降。

几丁质连接的凝集素的作用方式还不清楚，但已知道它对昆虫发育的损害（干扰营养吸收）需通过与围食膜的几丁质结合（围食膜能保护昆虫中肠的外廓）。其他禾本科凝集素、马铃薯凝集素、白屈菜凝集素以及薏苡种子αAI/几丁质酶等的植物防御性质也还未被定论。

UDA除阻止营养吸收外，还对几种产几丁质的真菌有强烈的抗菌特性，由于UDA也是用几丁质亲和层析柱纯化的，所以很重要的一点是证明观察到的效应不能归因于混有几丁质酶，因为几丁质酶也能结合在柱上并能阻碍真菌生长，UDA对某些真菌（如灰葡萄孢Botrytus cinerea）比几丁质酶更有效，而对另外种类则不然。

范帕利斯（Van Parijs）等（1990）证实hevein对真菌生长的阻碍，且hevein比UDA少三至五倍的抗菌活力，比烟草几丁质酶抗腐生菌小一个数量级的活力。尽管如此，hevein在300—500μg/ml时能阻碍植物致病其菌灰葡萄孢、尖镰孢（Fusarium oxysporum）、偃麦草核腔菌（Pyrenophora triticirepentis）等的生长，而烟草几丁质酶在1 mg/ml时还未有效应。

在培养基上如几丁质酶能引起菌丝尖端的溶菌作用，hevein和UDA则影响厚质菌丝的形成，这证明两种蛋白有着不同的作用模式。Broekaert等（1989）提出这些小几丁质连接的蛋白能与几丁质交联，阻碍细胞在菌丝尖端扩大，这种结合作为一个完整植物防御系统的第一道防线，能减缓真菌的生长。

结 论

我们提供的证据证明了具有凝集素性质的蛋白之间的两种演化关系。菜豆的PHA基因由一个先祖基因（所有基因还是连着的）通过复制和分离演化而来，结果使蛋白获得了不同的生物学特性。这也很可能是其他含结构相关蛋白的豆类的演化途径（这些蛋白中的某些或全部具有凝集性）。WGA的几丁质结合区域的特征明显地出现在一系列植物类型的基因中。谷类凝集素及其串联重复顺序明显地由这个区域的复制产生。所有这些蛋白具有抵抗含几丁质的病原体和摄食者的生物学作用。防御基因融合与复制行为的结合可能已经给予植物一个用多样的专一性产生新蛋白质的进化利益。

[Plant Cell，1991年1月］