前 言

现在各工业发达国家在制定和执行医疗福利政策时必然会遇到的两大问题是：（1）各国的人口老龄化速度在加快，如日本到了21世纪初叶时平均每4个人当中就有1个65岁以上的老年人；（2）医疗相关费用的开支有增无减，如美国的医疗费占联邦总预算的13%。

早日发现疑难病或性病并及时进行治疗，不仅有助于增强体质而且还能降低医疗费用。为此，很有必要研究开发能在全球普及的廉价且操作简单的屏蔽法和具有高感光度确诊法。曰本欧林巴斯光学工业公司已开发的是能以迅速、简便、自动检查的DNA系统（以下简称为本系统）。

全自动DNA检查系统的构想

由于抽出核酸（DNA、RNA）的技术和由聚合酶的连锁反应（PCR）引起的DNA增幅技术的进步，DNA检查已相当普及。然而，以往DNA检查的全过程并不都是全自动的，其检查方法也只是原来在研究室所作的DNA解析技术的模仿而已。

本系统是由检体前处理（抽出核酸）、PCR增幅、DNA测定器的反应及椭圆偏振光解析测定部等构成。开发本系统最终目标是全自动的全封闭系统，其各个环节所用的测定试药或模块全部由正交3轴机器人等运送。

本系统的核心技术：（1）用无载体电泳（自由流动电泳）的核酸抽出；（2）用微燃烧室使PCR高速增幅；（3）在半导体用硅芯片上使DNA探子固相化的光传感器；（4）能检测到埃单位［A］水平膜厚差的椭圆偏振光解析等。

检体前处理

从试料溶液分离与分取核酸的技术一般是采用超远心法或柱色谱法等。但这里使用的是自由流动电泳法，是可望实施自动化与小型化的无载体电泳法的一种。近年来，无载体电泳法虽然在生物学领域作为微量与高速分析法曾引起了人们的关注，其利用领域也在扩大，但在分取试料方面至今尚未达到实用化阶段。

现在正在开发中的模块是以玻璃薄膜为基础组成，利用半导体微细加工技术制作。模块尺寸是纵70 mm x横66 mm，电泳动部是40.1 mm x 50 mm，并加工为深度10~50 μm沟的基片与作为沟盖的基片能接合起来。泳动冲缓剂的注入口有6个，含有DNA的试料注入口有1个，在注入口与排出口之间的两端都配置着金属丝电极。

分离抽出的过程，首先从冲缓剂注入口以一定的速度促使冲缓剂流动，以致形成在排出口处的水流。再从试料入口处注入含有DNA的试料，这时在模块内的两种溶液几乎不混合而呈现出层流的状态。这时在两根电极间附加nkv电压时，含有试料内的物质就根据其电荷状态的不同，或者是向正电极一侧或者是向负电极一侧流动，并从排出口流走。其泳动方向是由冲缓剂的流速所控制着，DNA也就能从特定的排出口取出来。因采用的是无载体电泳动，从1个排出口就能分取试料中的核酸成分。

由于其附加电压之不同，其排出口的位置也就不同。但如果要使抽出核酸实现自动化，其必要条件是：（1）操作简便迅速；（2）高精度化；（3）高再现性；（4）高回收率等。本系统虽然已具备着1~3的条件，但为确保其分取量而不停地注入泳动冲缓剂时，其回收率处于下降的趋向，今后进一步提高其回收率仍是个课题。

高速PCR扩增

要使PCR发生的条件：（1）要有在高温中具有稳定性的聚合酶；（2）能作为DNA伸长反应用的4种DNTB材料；（3）铸锭型DNA；（4）要有一对可作为启发剂用的低分子量聚合物。这些物质在含有镁的冲缓剂中被混合后就在多达几十次温度变化中仍在循环。

在发生PCR后首先有双条锁链的铸锭型DNA发生热变性（93~95℃）后变成1条锁链。与双条锁链的铸锭型DNA相比，大量的启发剂使变成1条锁链的铸锭型DNA缓冷到55-72℃。接下来就是因耐热性DNA聚合酶起的作用，使缓冷的启发剂在铸锭型DNA的连续变化中相互得到了伸长。仅在一次循环中，铸锭型DNA的量就翻了一番，把这一连串的合成反应作为一个循环期，并把其所必要的次数重复的话，被夹在启发剂间的DNA断片就以指数式的增幅。

一般说来，利用铝制热处理部件作热的循环。在这热循环过程中，把温度的上升或下降的过程看得比在所定温度的潜伏时间更重要。以往都是利用薄壁试料容器来缩短升温或降温的时间，以提高其导热性来达到缩短增幅的时间。

在开发本系统时，运用半导体的加工技术开发PCR模块，其制作法与自由流动模块的制作过程一样。试制的模块是纵30 mm x横16 mm x厚0.3 mm的硅片，并作为硅片的反应层开了10 mm的角孔，用耐热性的聚酰亚酸树脂制薄膜堵底。

在聚酰亚酸制薄膜里埋藏着用钛［Ti］喷射过的加热器和温度传感器。在本系统中采用的PCR模块的优点：（1）因使用了良好导热性的硅基片，实现高速的升温或降温就有了条件，增幅所需时间也有可能缩短；（2）因其反应层都分别与加热器或温度传感器靠近，能把模块配置在试料溶液的近旁，正确控制温度也就有了可能；（3）现在的模块性能是在1秒钟内使试料温度升到94℃，对滑动PCR所作的实验结果是在40个循环期（94℃~68℃）总共约用30分钟就全部做完。

椭圆偏振光测试

以往是利用化学发光、荧光或比色法测试由PCR发生的增幅产物。比色法的反应过程是：（1）用DNA探子固相化的微珠或微板杂交；（2）以净洗进行B/F分离；（3）酶反应；（4）未反应酶的净洗；（5）由发色作用物产生酶发色；（6）测试吸光度。

开发本系统时是用DNA反射光对准着目标DNA杂种的直接光学手段进行测试增幅产物。其椭率测量术是自古以来就使用的手法，只是以往仅有一小部分研究人员在使用而已。其原因是由于要用两种变数来表示偏振光状态，其直感性的理解难，再说，为从被测试出来的偏振光状态去求检体的光学定数就必须进行复杂的计算。但自古以来，利用椭率测量术测试抗原-抗体反应的例子仍很多。

这次为以光学手段直接检测出在DNA中的杂化物而制作了具有高感光度且能折回光路型分光比较椭圆率计。把波长400~700 nm的氙光通过偏振光子（A）后，偏振光角45度的直线偏振光P成分射入于控制芯片C时，其被反射光就变成椭圆偏振光。这种光照射到反射棱镜（E）时不会改变其偏振状态，在棱镜内都作4次均为90度的反射之后，与人射光轴平行，并作为逆方向光出来。

这种椭圆偏振光在归路上就射入于芯片D，这时在C与D表面的膜厚或分子密度并无差异。要把反应阴性时的反射光的偏振光状态变换为与最初被射入状态一样的偏振光状态时，即也只能是P的成分。因检光子（B）被配置得同偏振光子（A）正交，P成分就无法通过检光子B而光线也无法进入于检测器（F）。在芯片D有阳性反应时，由于其反射光变成椭圆偏振光，其S成分为通过检光子B而可达到检测器F。

芯片C与D都是为DNA固相化的光传感器工作。这种光传感器的支撑体是具有平稳性的6 mm x 6 mm的nm级硅单结晶芯片，是利用交联剂把约30个碱原子团的DNA传感器固相化。把检查目标的DNA反应在这种光传感器就能得出其DNA的检查结果。

结束语

要构筑全自动DNA检查系统，就必须去攻克好几个课题，如何去攻克又是个问题。以临床检查为例来说，进入50年代后，机械化或自动化才正式取得了进展。这时能适合于自动化的各种检查法或自动控制技术被先后建立起来。如DNA检查时，因PCR反应是高速的增幅反应，由增加副产物的污染而引起的伪阳性就成了问题。通常，PCR反应的准备与对增加的副产物的解析都是在不同场所进行，检查用的器具或试验用药品等也应准备其专用品，以防止污染。

现在开发的模块几乎是封闭系统，但检查用的药等都是按原来的技术分项操作。为此，今后很有必要开发各种有关的周边技术，以防止污染。全自动DNA检测系统将对临床检查医学领域及其它相关领域带来及时而巨大的好处。预料其波及效果也巨大，如在微细加工技术或光传感器技术中的核心技术、生物化学的分析或免疫检查的应用，其用途愈来愈广。

［计量与控制（日）1998年10月］