在过去的好几年里，出现了“基因治疗”这样一个充满希望的新概念，它依据于这样的假设，即通过直接处理缺陷本身的位点——突变基因——而非突变基因的产品的次级或多级影响，就有可能根治遗传病。这涉及到用正常的、功能性的基因直接取代或补充缺失性的遗传信息。到20世纪70年代早期（重组DNA世纪以前），对肿瘤病毒转化细胞机制的了解，使基因治疗得到了早期的理论支持。DNA和RNA肿瘤病毒的分类使对基因治疗至关重要的那些功能得以精确地阐明，那就是将具功能的新的遗传信息稳定地导入哺乳动物细胞。因此有人提出，这样的病毒或其他类似的东西，在去除其有害的功能后，可以用作将正常的、功能基因导入人类细胞以纠正细胞缺陷并治愈遗传病的载体。

起初，研究人类疾病的遗传修正的研究者们面临着很多严重的观念的、技术的及伦理的问题，很多这样的问题在1980年克莱因（Cline）等用克隆的人β - 珠蛋白基因治疗地中海贫血的病人之后都已显露出来。从那时起，至少在某些遗传病，模型工作为合适的治疗靶子建立起了突变基因，这篇综述概括了最近的技术进展，并讨论了将来基因治疗的临床应用方法。

基因转移的策略——基因取代、修正、增添

基因治疗的一个理想方式是基因修正，即对突变基因序列特异的修正，而不引起靶基因组任何额外的改变。虽然基因修正直到最近似乎还同样困难，但外源序列的基因组定位导入（导致特异基因序列的修饰）现在在好几个哺乳类系统都已得到证实。好几个研究组表明，哺乳动物细胞包含了位点特异性的外源基因重组所需要的酶和结构装置。在大多数的同源重组研究中，定位导入的序列已通过磷酸钙介导的转染、电击或微注射等传统的基因转移方法导入细胞并在大量位点产生了点特异性的突变，包括小鼠胚泡干细胞中的HPRT和int-2位点。这些方法将用于很多其他的选择标记，以研究基因表达并为人类疾病建立动物模型。

比基因取代或修正建立得更多的是好几个基因增添的技术，那就是通过导入外源正常遗传信息，修饰缺陷细胞内突变基因的内容及表达的方法，在过去的10年里，发展了大量高效的方法来将功能性的新基因导入哺乳动物细胞。不可避免的是，外源序列在基因组中不平常位点的整合，将导致某些插入突变。由于相关的可能性，这种转基因的表达不可能被自然地加以调节，然而，因为一些类型的载体介导的基因转移的高效性，这种基因增添的模型受到了最多的关注并在基因治疗研究中提供了一些予人印象最深的进展。

病毒载体

应用能直接感染靶群体中每一个细胞的病毒载体，可以比物理方法更有效地将核酸转运进哺乳动物细胞。对转导病毒载体的发展，大多数研究者都集中在能整合进宿主基因组并高效而稳定地表达外源基因，但又不损伤宿主细胞的肿瘤病毒上。用作哺乳动物细胞表达载体或基因转移载体的第一个病毒是转化的DNA病毒，包括多瘤病毒（SV40和多瘤病毒）和腺病毒。这些病毒的基因组了解得很清楚，对当前很多载体的构建还是有用的转录序列源泉，但因为它们对外源序列的容量很小，随着对其他潜在的载体系统的发展，对它们的兴趣已经消减。

最近，将外源基因高效导入作为靶子的哺乳动物细胞最有用和最流行的模型载体来自于啮齿类和鸟类逆转录病毒。要想应用于临床，逆转录病毒载体必须能高效地感染并稳定地表达外源基因。

表达和稳定性 自从最初报道了逆转录病毒载体和辅助细胞方法以来，技术上的改进导致了更有用的载体的产生。有些只包含了从长末端重复序列表达的单一的功能。为了简化适宜的重组病毒生产细胞的分离程序，其他的逆转录病毒载体也表达一个选择标记，如使转染细胞具有药物抗性的转座子Tn5磷酸转移酶基因。

逆转录病毒载体超过其他的基因转移工具的一个受到普遍青睐的优点是逆转录病毒载体整合形式的结构和功能的稳定性。虽然很多逆转录病毒序列是稳定的，但好几个研究已经指出，前病毒就像其他的转基因一样，也能显示高频率的结构和功能的不稳定性，载体设计、靶细胞的特性、选择压力的存在或缺乏，以及所要表达的基因的特性等还没有完全了解的机制都可能成为载体不稳定的因素。

其他的病毒载体

逆转录病毒载体对很多类型的体外基因转移研究是很有用的，但相对低的滴度限制了它们在某些体外和大多数体内研究的应用。来源于痘苗病毒，腺相关病毒（AAV）、疱疹病毒、牛乳头状瘤病毒及其他病毒的表达载体的特性，可能使它们在哺乳动物细胞的长期遗传修饰的一些应用上富于吸引力。人类AAV病毒比逆转录病毒载体有大量潜在的优点，这包括它们在人类普遍存在的事实，并能被浓缩到超过10⁹感染单位/毫升的滴度。它们是完全非病原的整合病毒，需要与辅助的腺病毒或疱疹病毒共感染，以复制其5 kb的单链DNA基因组。

因为逆转录病毒载体只局限于复制的细胞，对非复制或充分分化的细胞（如神经元、肝细胞及其它的逆转录病毒不能感染的细胞）用高滴度的载体进行转导和表达的需要，使对来自于其他类型的非感染性病毒，如疱疹病毒的兴趣正日益增加。

体内转运与疾病模型

骨髓 在发展临床应用的基因转移技术中，很多工作都集中在补充体外培养的靶细胞的遗传缺陷，然后将得到的经过遗传修饰的细胞植入合适的体、内器官，用于植入的靶器官必须是相关疾病的位点，在体外易于处理和操作，并对遗传修饰方法敏感，更理想的是包含非复制细胞又包含循环干细胞，以便使遗传修正能保存下来，如只有分化的、复制的细胞被感染，新导入的基因功能将随着那些细胞的成熟和死亡而丢失，最后，应有可能将遗传修饰的细胞以有功能和稳定的形式重新植入有机体。因为哺乳类骨髓满足了所有这些条件，它成为早期基因治疗研究最富于吸引力的器官之一。

哺乳类骨髓中一定的细胞对逆转录病毒的感染是敏感的，在小鼠中进行的大量的研究表明，在体外培养的感染的骨髓细胞内通过逆转录病毒转运的基因，在某些情况下，能在重建的体内骨髓细胞中恢复酶活性达数月之久。

在动物研究的基础上，已经建议进行人类骨髓疾病的遗传治疗。目前最合适并最注重的研究模型是由腺苷脱氨酶（ADA）、嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）、高歇氏病等的缺陷引起的免疫缺陷疾病。这些及相似的紊乱目前要么进行症状性治疗，要么就ADA缺陷来说，进行酶取代治疗或通过从亲和供体进行骨髓移植来治疗。最近应用纯化并经聚乙三醇稳固的ADA，可能使更多的ADA缺陷的病人得到有效的治疗，而不需要进行基因治疗。

肝脏 肝脏在人类代谢和许多遗传病的表达中起着中心作用。成年哺乳类肝脏包含相对静止的、分化的肝细胞，不能被逆转录病毒感染。然而，分化的大鼠肝细胞在体外生长的脱分化期对逆转录病毒的感染是敏感的。研究者们利用这一发现，发展了用逆转录病毒介导的方法，在体外培养的原代肝细胞中表达了大量的基因，包括与疾病有关的基因，如人类低密度脂蛋白受体（LDLR）、苯丙氨酸羟化酶、α₁ - 抗胰蛋白酶。α₁ - 抗胰蛋白酶已被并入苯丙氨酸羟化酶的逆转录病毒载体，以使逆转录病毒介导的基因转移具有肝特异性。现在的任务是发展高效的方法，将经遗传修饰的肝细胞重新植回受体动物体内，以恢复其缺陷，理想的是，发展能在体内直接导入肝细胞的载体，而不必进行体外的遗传操作和细胞移植。植入大鼠腹腔和脾脏的肝细胞长期存活的报道，提示植入遗传修饰的肝细胞以产生表型的改变是可行的。另一方面，通过肝脏组织活检从病人分离大量肝细胞来进行体外遗传操作的繁琐，使我们非常希望能将载体直接转运进肝脏。

中枢神经系统（CNS）——遗传和非遗传疾病 由x连锁的HPRT基因的缺陷引起的中枢神经性损坏的Lesch-Nyhan病，已经成为发展人类基因治疗一般技术及中枢神经系统遗传修饰途径最有用的模型之一。关于这种紊乱及其他紊乱，如早老痴呆和帕金森氏病的实验已清楚表明，修正缺乏功能的哺乳类CNS的道路并非完全平坦。治疗CNS紊乱的遗传途径的模型难于建立，这是由于（ⅰ）关于正常的和异常的CNS功能还知道得很少；（ⅱ）CNS的器官及其细胞用物理的和生理的方法都难于接近；（ⅲ）影响CNS功能的大多数紊乱都可能是多基因或多因子作用的结果。更进一步说，大多数CNS紊乱的靶细胞——神经元——是后减数分裂的，因此对逆转录病毒的感染是不育的。我和我的同事建议，将体外基因转移与将细胞植入哺乳类脑的特定区域结合起来，作为恢复至少某些CNS缺陷的功能的途径。从技术和伦理两方面来说，似乎都最好设计一种经遗传修饰的自动的细胞来产生需要的产品，而不依赖于自然发生的人类供体细胞。

癌症 因为可能大多数人类癌症是由于异常基因表达所引起或与异常基因表达有关，所以人类癌症应看作一种遗传病。最近对发育和细胞增殖中生长因子和原癌基因角色的定性，开始提出了扩展目前化疗和辐射治疗的遗传途径。现在，最简单的遗传模型涉及到来自抗癌基因缺陷而造成的肿瘤形成，如与人视网膜母细胞瘤（Rb）和Wilm's肿瘤显然有关的那些抗癌基因。这些癌症可以假设是由野生型基因的两个等位位点的同时失活引起的。因此通过从野生型基因恢复功能表达，可能使癌症表型受到抑制甚至被逆转。我和我的同事在一个研究中的结果支持了这一途径：用表达野生型的Rb基因的逆转录病毒载体感染Rb和成骨肉瘤细胞，导致了其形态上的改变和体外停泊依赖性生长特性的恢复，在Rb细胞的情况里，还导致了其在裸鼠中致瘤特性的抑制。需要进一步的研究来确定抑癌基因表达的恢复对细胞特性、复制、Rb缺陷纯合或杂合细胞的致瘤性的长期影响，以及确定是否它还可能诱导已存在的肿瘤的逆转。其他抑癌基因缺陷的类似的研究对建立这种治疗的一般方法是很重要的。

使显性作用的癌基因失活，想象起来更是困难，但已建议通过一种新的方法进行点特异性的突变。现在有好几种方法可用于细胞内毒素基因的表达。从原理上看，如果准确的特异性的转运能重复完成，这使肿瘤细胞的定点摧毁完全成为可能，在另一种途径中，将药物敏感基因定向导入肿瘤细胞，使其单独对药物处理敏感，就像将HPRT基因导入巯基鸟嘌呤抗性的人白血病细胞，使其对嘌呤类似物代谢敏感一样。

在体内直接进行载体转运

与体外基因转移再进行细胞移植相反，一种理论上更富于吸引力、但发展得更缓慢的途径是，直接将基因转移载体导入体内的靶器官，这种途径需要制备浓缩的或高滴度的转导病毒载体或其他的物理的基因转移运载物。逆转录病毒不易用于体内的基因转运，因为病毒滴度与其必需感染的细胞相比普遍太低，并且它们一般没有细胞向性。

其他物理性制品，包括裸露的质粒或包装在可定向的脂质体或红细胞血影的克隆的基因，已用于将基因、蛋白质、毒素及其他制剂直接导入整体动物。体内脂质体介导的基因转运已导致了外源干扰素1和前体干扰素基因在受体大鼠中的表达，好几个研究已证实，将裸露的磷酸钙——沉淀的质粒直接注射进大鼠肝脏和脾脏，或将用蛋白质包装好的质粒直接注射进门静脉，导致了在肝中的基因表达。这些研究提示，在某些条件下，通过物理手段进行的直接的器官特异性基因转移是有效的，为了增进基因转运的效益，有可能利用组织或器官向性，例如应用来自神经向性病毒（如狂犬病毒或疱疹病毒）的载体将基因转移进CNS。因为大多数病原动物病毒的感染不是真正具有组织向性，但却喜欢在某一种组织中表达它们的细胞病原功能，更可能的是，组织特异性的载体将通过应用这些更杂乱的包含启动子、增强子及其他使基因表达具有组织特异性的序列来产生。在基因转运到一个单一器官可能还不充分，而需要整体范围的基因表达的情况里，只有复制能力的、具感染性、但非病原形式的载体也可能最终用于基因转运。

人类实验

长期等待的基因转移技术在人类的首次应用预料涉及到一个疾病相关的酶活力的治疗性恢复。最近美国国立卫生研究院（NIH）重组DNA咨询委员会、NIH的院长、食品与药物管理局已经批准了这样一个研究：肿瘤浸入淋巴细胞（TW）在体外用表达Neo基因作为选择标记的逆转录病毒感染后，再相应植入供体癌症病人，以研究TIL的命运。来自这一研究的资料打算用于指导对载体感染细胞植入的进一步研究，但来自这一研究的结果可能对TIL细胞、这一载体及基因具高度特一性。在大范围的人类临床研究开展前，应最终搬出其他的基因——靶细胞——载体组合的类似的研究。

通过这里描述的很多同样的方法可能发生人类生殖系细胞有意或无意的修饰。对生殖系进行操作以阻止遗传紊乱的潜在角色远非体细胞修饰那样明了。对生殖系遗传修饰的反响提示，它在技术上和伦理上充满了如此多不确定的因素，以致不应该付诸实施。然而，把它看得如此严重是不明智的并为时过早。有人提出，高效的控制疾病或防止早期发育中损伤的需要，或者对于处理那些难于接近的细胞的需要，可能会 · 最终对是否进行生殖系的基因治疗作出裁决。基因治疗中这一最多问题的方面还需要得到更多的检测。

[Science，1989年6月16日］