苏云金芽孢杆菌作为一种微生物杀虫剂使用,它比化学杀虫剂有更多的优点,因为有杀虫作用的晶体蛋白(ICPs)具有特异性,对非靶昆虫、脊椎动物、环境及使用者都无毒害作用。由于要求减少化学杀虫剂使用的压力越来越大,可以在开发改进型的苏云金芽孢杆菌产品的努力也随之增加。但目前,晶体蛋白(ICPs)在田间的稳定性还很低,产品的费用相对比较高,且杀虫种类的范围有限,因此,苏云金芽孢杆菌产品的需求价值为5千万美元,仅占全球杀虫剂市场的1%。最近,ICP基因导入农作物中,使其具有抗虫害能力。该项技术的发展,将会拓开苏云金芽孢杆菌产品的实用范围。这种抗虫害的转基因植物的应用,将排除了杀虫剂的稳定性的问题,也大大降低控制虫害的费用。如今,30多种农作物已转导成功,包括一些主要农作物,如玉米、棉花、大豆和水稻。预计在这10年内,具有ICP基因的抗虫害植物,将成为第一批商品化的转基因植物品种的一部分。值得一提的是,大规模地采用具有单基因抗性的农作物,可能会迅速导致昆虫群体中抗性的发展。而且,与直接喷洒相比,转基因植物体内的ICP残留量更多,会增加选择的压力和产生抗性的危险。化学杀虫剂的实验已证明,在足够的选择压力下,大多数种类的昆虫都将对所用杀虫剂产生一定忍耐力(抗性)。很长时间内,支持使用苏云金芽孢杆菌的人,则认为微生物杀虫剂不会引起昆虫的抗性。但是在实验室条件下,印度谷螟已经对苏云金芽孢杆菌产生了抗性。更严重的是,菜蛾对苏云金芽孢杆菌田间抗性的增强,已经表明了这可能真是个问题了。

防止昆虫的适应性

为了保证苏云金芽孢杆菌继续有效的应用,我们应对昆虫抗性问题采取预先的措施,以消除或减少产生抗性的可能性。最近的一些发现,可能为制定这一战略提供了基础。

首先,ICP蛋白——昆虫的不同组合表明,毒性与昆虫中肠的刷缘膜上不同感受器(ICP的作用点)的关系。例如,CryⅠA(b)和CryⅠB毒素均对大菜粉蝶有毒性,但对烟草天蛾仅CryⅠA(b)是有毒的。这两种毒素都能与大菜粉蝶的高亲和性感受器结合,而CryⅠA(b)仅不能与烟草天蛾的膜感受器结合。这表明,感受器上结合的状况,很大程度上说明了昆虫的敏感范围。这些昆虫各自对独特类型的ICP蛋白敏感。此外,感受器结合的研究已指明,一种昆虫可以对几种不同的ICP蛋白敏感,这取决于昆虫中肠壁上所具有的不同感受器。例如,已经证实,CryⅠA(b)和CryⅠB毒素可以识别大菜粉蝶的不同感受器。这些感受器分子似乎是糖蛋白。如今,在鳞翅目中,7种昆虫不同的专一ICP蛋白已被确定,每一种中至少有一条氨基酸顺序已知。人们已做了一些尝试,企图确定ICP蛋白中专性作用的区域。这些研究表明(至少CryⅡA和CryⅠA(a)是如此)ICP蛋白毒性专一性的区域在C - 末端部分,还未发现在蛋白顺序或结构型上与ICP蛋白结合或毒性有明显的联系。我们已经证实,对于ICP蛋白的专一性来说,与高亲和性的膜感受器结合是关键的决定因素,这引起人们推测:结合位点也在毒蛋白具C-末端的那一部分上。事实上,通过杂交ICP蛋白的研究,已证实至少在CryⅠ C这一类毒蛋白中,参与结合的多肽片段在C-末端(G. Honée等,未出版),由此可知,CryⅠA(b),CryⅠA(e)和CryⅠC这些ICP蛋白是由两个结构区域组成(Refs11、12和13,各自独立),可能这两个区域的结构是大多数苏云金芽孢杆菌的ICP蛋白的普遍特性。这种结构可以表现出功能区域的作用,C-末端区域参与专一性的作用,而N-末端区域可能通过微孔的形成而具有毒性。我们已研究了所知的对鳞翅目专一的ICP蛋白与一系列昆虫结合,发现这两者间总能发生关联。这些研究表明,对于昆虫膜感受器来说,每一种都有一到多种ICP蛋白能与之结合。

其次,上述所提到的印度谷螟的抗性形成,与一种ICP蛋白对膜感受器的亲和性减少50倍相关。有趣的是,抗性品种对其他ICP蛋白保持敏感。这种特性,在选择制剂(也即商用苏云金芽孢杆菌)作用下,是不出现的。实际上,与敏感的品种比较,这些抗性品种对这种ICP蛋白的抗性增加了,这显然是由于结合能力增强的缘故。另外,在这种情况下,这两种ICP蛋白可识别不同的结合位点,ICP蛋白的膜受体极不可能结合ICP蛋白是它唯一的功能。因此,可以设想,在昆虫的中肠中,它们还有一些未知的生理作用。很有趣地注意到,在抗性品种中发生两种变化:(1)一种ICP蛋白受体的亲和力降低;(2)其他种ICP蛋白受体的浓度增高(在印度谷螟品种中并未出现后一种变化)。这些抗性品种,不仅ICP蛋白的结合功能改变,而且第一类受体的正常生理功能也有所变化,功能的丧失,则通过其他受体浓度的增加而得到弥补。最近,我们证实,在田间已有抗性的菜蛾品种,和实验室选择得到的印度谷螟一样,其抗性是由于一种ICP蛋白膜受体的改变。这种昆虫对其他类型ICP蛋白保持敏感,而对田间使用的苏云金芽孢杆菌变种并未出现这种现象。由此可见,这些ICP蛋白与受体结合,在敏感和抗性品种中具有截然不同的结合特性。因此,具有田间抗性的菜蛾品种和实验室选择得到的印度谷螟品种,其抗性的生化机制是相同的。这说明,ICP蛋白膜受体的改变,是一种普遍的机制,从而昆虫能对苏云金芽孢杆菌产生抗性。

最后,这些结果说明了转基因植物能表达不同的ICP蛋白、这些蛋白与不同的受体结合可能是防止抗性的有价值战略。事实上,人们已经普遍认识到,使用具有不同作用位点的多种杀虫剂混合物,将会减缓抗性的产生。根据这种理论模型,混合杀虫剂的使用效果,优于其他方法。

模型的设想根据如下:

(1))每种杀虫剂的抗性是独立受控制的(指没有交叉抗性)且是隐性单基因的;

(2)双抗性的个体很稀少;

(3)部分植物未处理;

(4)杀虫剂具有相同的存留时间。

这些标准似乎与印度谷螟的抗性状况很相符,其两种测试的ICP蛋白没有交叉抗性,选择条件下的抗性是单基因,且至少是部分隐性。ICP蛋白还有待于有相等的残留时间,当然在植物中表达时,能通过两种类型的植株种子而得到一个混合植物群落(敏感和抗性植物)。

ICP基因表达的精细调节以减小选择的压力

不管使用单个ICP基因的植株,还是多个的,都应尽力使选择压力保持在尽可能低的水平 · 那些对虫害非常敏感的植物组织,限制其1℃P基因的表达,则减轻选择的压力,而同时仍具有强的保护作用。例如,在棉花中,通过利用组织特异性的调节顺序来表达ICP基因,使ICP基因的表达,仅被限制于棉铃中。有证据表明,蛋白具有抗食(anti-feedant)特性。因此,害虫的幼虫会迁移到植物未受保护的部位去。这样,对棉花不会造成重大损失,因棉花经得起一定的叶损伤。另一种方法,在生长期的特定阶段,激活ICP基因的表达,使其在短时间内具有保护作用。

具有精细调节ICP基因表达的转基因植物,使成为综合治理害虫(IPM)措施的一部分,其中,对于重大的害虫控制措施,仅在考虑经济损失后,才得以实施。这些技术的运用,通常是为了减少杀虫剂的使用,降低选择压力。例如,具棉铃特异性ICP基因表达能力的棉花品种,当遇到虫害密度高时,则需要化学杀虫剂的帮助。在棉田观察中,如果估计虫害密度高时,则对这些棉花品种采取综合治理虫害(IPM)的办法。另一种不同的措施,改进一类植物表达产生ICP蛋白,且仅对专一性虫害产生限制,在这方面,损伤可诱导启动子的鉴定,是个重要的手段。

未来展望

对付害虫最好的办法,是植物的抗性遗传基础。由于在昆虫对苏云金芽孢杆菌抗性的遗传价值方面,人们已作了详细研究,所以分子生物学家应继续研究植物DNA调节顺序,使其仅在可希望的空间位置或短暂时期内表达产生ICP蛋白。人们对昆虫和植物间相互作用的更深了解,必将为特定的农作物,将会导致更复杂的抗性处理方法的发展。田间的研究,必须监视昆虫可能产生的适应性,注意不能大面积地种植单一转基因农作物品种。从这些研究中可得到的经验,将使我们能够仔细调整对策。这些措施,可能对保证苏云金芽孢杆菌ICP的长期有效性是必需的。这方案是抑制抗性发展的潜在危险,也许ICP基因“消失”在昆虫中,将会得到新的抗虫因子,但不知多长时间才能推出这样的品种,

[Tibtech,1991年6月第9卷]