1974年，柯勒和米尔斯坦运用乔纳等人的理论，选择经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞和在体外培养中能持续繁殖的小鼠骨髓瘤细胞系作为融合材料试验将它们融合，以期得到具有两种亲本细胞各自特点（特定分泌抗体的免疫功能和持续繁殖能力）的杂交细胞。这一研究工作取得了决定性的突破。1975年8月7日，这两位科学家在英国《自然》杂志上联名发表了题为“分泌预定特异性抗体融合细胞的持续培养”的著名论文，从而宣告了单克隆抗体杂交瘤技术的正式诞生。其后的十年来，各国科学家在此基础上，一方面继续研究开发各种细胞杂交、单克隆抗体制备、大规模培养和纯化等技术，一方面开拓发展单克隆抗体的应用领域，使单克隆抗体的生产逐步扩大，成为生物技术产业的重要分支之一。

自柯勒和米尔斯坦创立杂交瘤技术以来，制备单克隆抗体的主要方法，是用免疫小鼠的细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞融合，制备分泌单克隆抗体的杂交瘤。用此法获得的小鼠单克隆抗体是异种蛋白，用于临床诊断和治疗存在许多问题。例如人体会产生抗小鼠单克隆抗体的抗体，从而使小鼠单克隆抗体失、效。此外，该异体蛋白有引起人体产生各种过敏反应的危险等。因此，为了克服这些缺点，国外科学家十分重视研究发展单克隆抗体的新的制备途径，以及能大量制备单克隆抗体的大规模培养技术和分离、纯化方法。在近五年中各国科学家发表了数以百计的专利。

多种杂交技术相继问世

国外，在研究单克隆抗体制备技术中，以人体细胞作为融合材料来制备人单克隆抗体已日益成为重点，几种有希望的技术相继问世。此外，还出现了对人单克隆抗体及小鼠单克隆抗体等抗体的制备都可适用的几种新技术，例如杂交 - 杂交瘤技术和微囊法培养技术等。兹将各种杂交新技术的研究情况综述如下。

1. EB病，毒体外转化人淋巴细胞技术

EB病毒对人和部分灵长类的B淋巴细胞具有特异的亲和性，感染的B淋巴细胞可转变为产生抗体的淋巴母细胞，并能无限增殖。应用EB病毒体外转化人淋巴细胞制备人单克隆抗体的主要步骤是：（1）从外周血、淋巴结或脾脏等中分离出人淋巴细胞；（2）用EB病毒感染和建立淋巴母细胞；（3）待EB病毒感染的淋巴细胞增殖、克隆长至足够大时，进行抗体产生的筛选。筛选方法有固相放射免疫测定法、荧光抗体法及酶抗体法等。根据所需抗体的种类，选用适合的筛选方法；（4）淋巴母细胞克隆化；（5）抗体产生克隆的维持。获得产生所需抗体的克隆后，一部分继续传代，一部分冷冻于液氮中，作必要的早期保存。

近年来，应用此技术制备人单克隆抗体的研究取得了进展。斯泰尼茨（Steinitz）等科学家从供体外周血中选择出分泌特定抗体的B细胞，在其培养液中加入含有EB病毒的上清，培养1 ~ 3周后，发现感染的淋巴母细胞呈丛生状生长，培养上清含有特异性的抗体（10 ~ 12微克/毫升）。其中，有些细胞经克隆化后，继续生长并分泌抗体达一年之久。格劳福特（Crawford）等科学家采用类似的方法，从产生Rh-D抗供者的外周血中，分离出单个核细胞，以EB病毒感染，使B细胞母细胞转化并及时克隆化，所获得的一分泌R-D人单克隆抗体细胞系在体外培养的条件下，稳定地分泌抗体达九个月之久。

目前，此技术作为常规的操作尚不成熟，存在抗体分泌不稳定、数量较低（一般均低于1微克/毫升）以及不能用特定抗原对人体进行免疫，从而不易选择出产生某些特定抗体的克隆。将来，若能建立体外致敏淋巴细胞的方法，选择产生所需抗体的淋巴细胞，用此法制备抗各种抗原的人单克隆抗体或许是可行的。特别是在适合于人 - 人杂交瘤的骨髓细胞出现之前，以EB病毒转化癌所属淋巴结的淋巴细胞，在体外使之产生抗体，继而制备出异种杂交瘤，很可能是一种制备人单克隆抗体的优良方法。

2. 人 - 人杂交瘤技术

人 - 人杂交瘤系由同'种间体细胞融合所获得的。其染色体结构较异种间杂交瘤细胞稳定得多。因此科学家普遍以为人 - 人杂交瘤可能是研究特异性人单克隆抗体的最理想的来源。

在研究人 - 人杂交瘤技术时，起初采用人浆细胞瘤具有可分泌不同亚类的免疫球蛋白、粗面内质网丰富，少数散在的多核糖体，较多的线粒体和高度发展了高尔基器，多为非整倍体，从未带有EB病毒学特点，国外许多科学家经过多年的努力，建立了十余株具有上述特点的人浆细胞瘤系。然而，在这些细胞系中仅筛选出2 ~ 3株HGPRT - 突变型细胞株，对HAT敏感，可用作人 - 人融合细胞的亲本细胞。用人浆细胞瘤系与人B细胞杂交的初步实验结果表明，形成的杂交瘤频率低（＜1/10-7淋巴细胞），分泌的抗体量少（1微克/毫升）。

目前，不少科学家改用人淋巴母细胞作为融合细胞的亲代来制备人 - 人杂交瘤。克罗斯（Croce）等人在1980年用一株来自GW1500（人淋巴母细胞）并经6－硫鸟嘌呤筛选的突变株GW1500-6 GT-2，与一例亚急性、硬化性、多发性脑炎患者的PBL融合，获得了6株分泌抗麻疹病毒的人单克隆抗体的杂交瘤。其杂交频率为18/1×10-7淋巴细胞。其他科学家用此细胞株与糖尿病患者的PBL中的单个核细胞融合，杂交瘤成功率为25/1×10-7单个核细胞，不过其中有一株克隆化，分泌针对胰岛的特异免疫球蛋白M。这株杂交瘤分泌抗体虽达一年之久，但水平较低（0.4微克/毫升）。

国外研究以人 - 人杂交瘤分泌人单克隆抗体的时间不长，虽然至今取得的结果不理想，但是仍将继续探索0

3. 人 - 鼠杂交技术

人 - 鼠杂交技术产生的人单克隆抗体，对于研究人免疫球蛋白的基因图谱，或者用作探针来确定产生人免疫球蛋白的mRNA和cDNA，阐明膜u链结构以及研究人B细胞恶性增生的免疫生物学，均是非常有意义的。

1978年，施瓦本（Schwaben）等人报道了用人淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交后，获得能分泌人免疫球蛋白的杂交瘸。几乎同时，利维（Levy）等人用慢性淋巴细胞白血病人的外周血淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，建立了可大量分泌人免疫球蛋白的杂交瘤细胞系（在组织培养液中维持数月）。此后，西隆（Scilom）等人，以及西科拉（Sikora）和赖特（Wright）等人，先后用乳癌和肺癌患者的引流区淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得了能分泌针对相应肿瘤抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

从现在的研究情况看，以人 - 鼠种间杂交所获得的杂交瘤分泌免疫球蛋白的能力，一般不如鼠 - 鼠杂交的稳定。其原因可能是人染色体易于丢失，或者控制免疫球蛋白基因表达能力丧失等机制。鉴此，有的科学家认为如能及时克隆化和次代筛选（Sub-selection），有可能获得能稳定分泌人免疫球蛋白的人 - 鼠杂交瘤系。因此，今后国外也将继续研究及完善以人 - 鼠杂交技术生产人单克隆抗体的方法。

4. EB病毒转化 - 杂交技术

B细胞先经EB病毒转化，然后与鼠浆细胞瘤或人淋巴母细胞进行体细胞融合，是建立产生人单克隆抗体的细胞系的又一条可行的途径。

库兹博（Kozbor）等人将一株经EB病毒转化后分泌抗破伤风类毒素抗体的细胞系B6，与鼠骨髓瘤细胞融合，然后，添加乌巴因（一种细胞抑制剂）和HAT培养基进行选择。由此建立的杂交瘤在第九天产生抗破伤风类毒素人单克隆抗体，产量为2微克/毫升，比其亲本细胞B61的免疫球蛋白产量高两倍。但是，该株杂交瘤在体外连续培养仅6个月后就丧失分泌抗体的能力。究其原因可能仍是同种间杂交时人染色体在培养过程中丢失有关。最近，库兹博用经过破伤风类毒素免疫的供者PBL，在体外以破伤风类毒素刺激，再经EB病毒转化后，与人淋巴母细胞KR-4杂交（KR-4是以低剂量伽马射线照射人淋巴母细胞GM6 TG-2所获得的一株既对6 - 硫鸟嘌呤有抵抗力，也对乌巴因有耐受力的细胞系），所获得的杂交瘤频率（36×10-7）大大高于仅用破伤风类毒素进行体外刺激的水平。用此法获得的杂交瘤的异抗体分泌量较未用EB病毒转化的高5倍（P＜0.001）。

5. DNA转染技术（trasfection）

1983年，美国宾州大学医学院乔纳克（Jonak）和肯尼特（Keonett）等人发展了一种崭新的人单克隆抗体生产技术。他们一反常规做法，不采用体细胞融合及EB病毒转化的途径，而是用人白血病REH细胞系分离的DNA渗入经抗原致敏的小鼠脾细胞。此株经REH细胞DNA转染的脾淋巴细胞产生一种单价特异性的抗REH抗体。业经证明，被转染的脾细胞能产生分泌免疫球蛋白G和M的克隆株。这些克隆株在体外培养中可稳定分泌抗体。

此转染技术不需要用某一特定的基因片断，而只需以简单的硫酸钙沉淀法提取肿瘤细胞的DNA，一旦开发成功，有可能明显地简化或减轻以杂交瘤技术制备单克隆抗体时的生产操作。但是，目前转染的小鼠淋巴细胞分泌的免疫球蛋白的数量同小鼠杂交瘤细胞分泌的水平相似，并且转染体的效率也不肯定，在体外培养中生长很慢，能获得的抗体有限。简言之，在制备鼠单克隆抗体方面，DNA转染技术并不优于细胞融合法。现在，肯尼特实验室正在研究角小鼠肿瘤细胞DNA转染冬B细胞，使之有可能掺入到特种抗原致敏的人B细胞，以制备人单克隆抗体，乔纳克实验室正在筛选各种培养基联合使用的配方，以提高转染体的生长率，从而提高抗体的分泌水平。

6. 杂交 - 杂交瘤技术（hybrid hybridoma）

1984年，单克隆抗体制备技术创始人之 ~ 的米尔斯坦博士及其同事，又创造了杂交 - 杂交瘤技术，将单克隆抗体制备技术的发展推向新的阶段。

此技术生产的单克隆抗体是双特异性抗体。它是结构上双价，功能上单价的免疫球蛋白分子。它的Y形基本结构中的两个Fab臂的结构和功能各不相同，结合两种不同的抗原。

此技术与一般杂交瘤技术相类似，操作方法和所用试剂也大部分相同，产生杂交 - 杂交瘤细胞的方法有杂交瘤 - 脾细胞隔合和杂交瘤 - 杂交瘤融合等。杂交 - 杂交瘤细胞形成以后，不仅分泌双特异性单克隆抗体，还分泌两亲代杂交瘤产生的亲代单特异性抗体，要用适当的方法筛选。例如，筛选抗某抗原 - 抗过氧化物酶的双特异性单克隆抗体可用免疫化学方法，也可用免疫组化技术。

双特异性单克隆抗体的大量制备途径同一般单克隆抗体的大量制备途径相类似，可制备腹水或大量细胞培养。由于杂交 - 杂交瘤细胞的基因来源复杂，制备腹水只能在裸鼠腹腔内接种进行。大量细胞培养最好用无血清培养基，以避免胎牛血清组分对抗体纯化的影响。纯化操作可采用阴离子交换层析技术，线性洗脱后可得到三个峰，中峰为双特异性单克隆抗体。

双特异性单克隆抗体才出现两年，许多研究工作正在探索之中。

7. 一次脾内注射免疫技术

施皮茨 · 马（Spitz M）等人在《免疫方法杂志》4984年第70卷第1期上，发表了一 篇论文：介绍一种新的制备单克隆抗体的免疫方法。其操作是：将20微克可溶性抗原或2 ~ 2.5×105个细胞溶于50 ~ 100微升PBS缓冲液内。按每克鼠重6 ~ 7微克，给小鼠腹腔内注射戊巴比妥进行麻醉，按外科常规剪毛，消毒皮肤，切开前腹壁（切口长1 ~ 1.5厘米），暴露脾脏，按外科常规关闭腹腔。在注射后的第4天，杀鼠取脾。其余操作步骤按常规方法进行。用此技术已制备出抗人免疫球蛋白，凝血因子，人淋巴活素和人外周血细胞的单克隆抗体。同其它常用免疫方法比较，一次免疫方法所取得的结果更好，具有节省抗原和时间、简便及无需佐剂等优点，尤其适用于抗原量少时的免疫。

此外，加利福尼亚大学的马克 · 格拉西（Mark C. Glassy）等人建立了一株耐6－巯基嘌呤的人二倍体淋巴细胞系UC729-6。用UC729-6作为融合材料，有助于得到稳定的人杂交瘤，从而有助于解决因稳定分泌免疫球蛋白的人杂交瘤的产生和增殖存在困难而造成的人单克隆抗体的产生受到一定限制的问题。荷兰放射生物学研究所的格雷夫 · 坎普（Grave Kamp R.）等人，在用细胞毒性T淋巴细胞作融合材料以建立杂交瘤时，为了预防此细胞溶解其融合伙伴，使用了在聚乙二醇作用下和电场作用下两种不同的融合技术。在实施前一技术前，先用胰蛋白酶处理或加热，以使此细胞的毒性作用暂时降低。在实施后一技术时，不会或没有发生融合细胞的溶解，此细胞不需要预处理。电融合技术还有一个优点，融合的细胞可以用显微操作技术来选择，并可在不需要HAT选择的情况下增殖。

细胞大量培养技术出现突破

细胞大量培养技术是工业化生产克隆抗体的关键之一，美国、西欧和日本都在加紧研究开发。研究开发的基础技术是无血清培养技术、高密度培养技术以及不同细胞的最适培养工艺等。目前，研究开发工作进展显著，并有所突破，无血清培养基上市，微囊法和用牛或羊的子宫培养法相继出现。

日本通产省为发展高技术产业而制定的《下一代产业基础技术研究开发制度》，列有十大基础技术研究开发项目，细胞大量培养技术是其中的一项。此项目分为五大课题，即：① 采用无血清最适培养工艺的工业生产法；② 采用无血清高密度培养工艺的工业生产法；③ 采用浮游细胞系、准浮游细胞系的工业生产法；④ 采用骨髓细胞的工业生产法；⑤ 采用上皮细胞的工业生产法。每个大课题又细分为若干子课题。研究开发期限规定为从1981年到1989年，分三个阶段进行。研究开发工作基本上由日本一些主要的发酵企业、制药企业及化工企业分担。从1981年到1983年或1984年的第一阶段研究工作已完成。其中的课题有：① 味之素公司的淋巴细胞高密度无血清培养；② 协和发酵工业公司的以中等规模培养的大量培养动物细胞和利用细胞增殖因子代替血清；③ 旭化成工业公司的骨髓性白血病细胞的分化诱导培养法和骨髓性白血病细胞的无血清分化诱导培养基加工的研究；④ 东洋酿造公司的上皮性细胞的株化及其无血清培养；⑤ 武田药品工业公司的细胞培养法生产抗体等。从中可见国外细胞大量培养技术研究动向的一斑。

1. 无血清培养基上市

不久前，日本药物开发公司研制成功无血清培养基。此培养基不含外来蛋白质，使用时可确保培养出纯的杂交瘤。其他的优点包括：① 用它培养的杂交瘤，其繁殖力与用传统的血清培养基培养的杂交瘤相同，而其抗体生产力却比后者高得多；② 用它继代培养杂交瘤时，杂交瘤的繁殖力和抗体生产力能保持不变，再生产能力良好；③ 用它配制的每批培养基的特性变化不大，因此可获得稳定的试验结果；④ 用它培养杂交瘤产生抗体时，抗体的分离很容易，因此可提高抗体的收率。此外，它比胎牛血清培养基便宜。目前，用它培养人脾细胞淋巴细胞杂交瘤生产人 - 人单克隆抗体的试验已获成功。日本药物开发公司计划通过三广公司出售它的无血清培养基。其商品名为“Hyb-rity-1”，剂型有粉状和液状两种。

2. 用微囊法生产单克隆抗体

戴蒙生物技术（Damon Biotech）公司的利特菲尔德（Littlefielol S. G）等人和格里迪纳（Gridna T. A）等人分别研究了用微囊法培养鼠 - 鼠杂交瘤或人 - 人杂交瘤，生产单克隆抗体的技术，微囊法所用培养基与常规液体培养法相同，使用改良的Williams培养基（含10%的热灭活的小牛血清，6 mM谷氨酰胺，1 mM丙酮酸钠，以及100单位1100微克青霉素/链霉素/毫升）。液体培养法每天取样，而微囊法每3 ~ 4天取样。微囊法同液体法比较具有以下优点：①它的最大细胞密度几乎是液体法的10倍，即微囊法为1.1×107细胞/毫升囊内容积，液体法为9.6×106细胞/毫升；②它产生的抗体超过90微克/106细胞，液体法是100 ~ 200 ng/106细胞。微囊法的微囊/培养基容积比为20%，故收获时囊内人单克隆抗体的最终浓度实际达到0.9 ~ 1.1毫克/毫升；③ 它产生的人单克隆抗体的数量占总蛋白含量的52%，液体法不到1%，产品纯度较高。

3. 用牛或羊的子宫生产单克隆抗体

美国国际单克隆制备公司与堪萨斯州大学的科学家们合作建立了借用牛或羊的子宫大量生产单克隆抗体的新方法。研究者们宣称初步研究已获得相当成功，尽管是取得初步结果，并且在过渡到大量生产单克隆抗体前还有许多工作要进行，但是事实已表明此法有希望用于大量生产单克隆抗体。应用此法生产单克隆抗体时，细胞系适应生产系统需要几天甚至数周时间，抗体的产生需要30 ~ 60天，每只动物可产生数升抗体溶液，抗体的含量估计为5 ~ 20毫克/毫升。此法的生产率可同戴蒙生物技术公司的微囊法培养技术相媲美（其细胞适应期为1 ~ 3周）。目前，国际单克隆制备公司已用此法生产单克隆抗体，在13个国家中获得各种技术专利。

纯化技术研究取得进展

至今，以杂交瘤技术产生的单克隆抗体一般都包含在细胞培养上清、腹水或血清中，其中含有大量杂蛋白及其他大分子物质，若不进行纯化处理，必定严重影响单克隆抗体的应用，纯化效果不佳，肯定显著降低单克隆抗体生产的经济效益。因此，近年来，国外对单克隆抗体的纯化过程的研究相当重视。当前单克隆抗体的制备仍以鼠 - 鼠杂交瘤技术为主。本文着重综述小鼠单克隆抗体的纯化技术研究进展。兹将近年报道的各种小鼠单克隆抗体纯化方法及其进展简介如下。

1. 盐析法

最常用的是以硫酸铵盐析。在含单克隆抗体的培养上清、腹水，或血清中，加入硫酸铵溶液，使其最终饱和程度达到45%。经过搅拌、离心、除去上清后，用45%饱和硫酸铵溶液盐析一次。也可直接用40%饱和硫酸铵溶液沉淀。除硫酸铵外，还可采用16%的硫酸钠。

2. 凝胶过滤法

此法可用于纯化免疫球蛋白M类和G类单克隆抗体，先将含单克隆抗体的腹水过滤、离心净化，用硫酸铵沉淀粗提后，加入于Sephadex G200柱中，以PBC洗脱，出现三个蛋白峰。其中一个排阻峰含脂类及免疫球蛋白M类，两个内流峰含血清白蛋白及免疫球蛋白G类。免疫球蛋白M类，两个内流峰含血清白蛋白及免疫球蛋白G类。免疫球蛋白G类纯化后，纯度超过90%

3. 离子交换层析法

此法应用较多，通常与盐析法联合使用，将含单克隆抗体的产物用16%的硫酸钠沉淀粗提后，加到以含50 mM氯化钠、3 mM硝酸钠的25 mM-TriS/盐酸缓冲液（PH7.5）平衡的DE-52层析柱，接着再用70 mM氯化钠洗脱。国外在实验中，已用此法纯化免疫球蛋白G类和抗癌胚抗原单克隆抗体。最近国外合成了一种新的弱阴离子交换剂，用于从小鼠腹水中纯化单克隆抗体的高效离子交换层析柱。它在操作中用磷酸盐梯度洗脱，时间大约为20分钟。此高效柱可纯化所有免疫球蛋白G亚类单克隆抗体，样品回收率均达95%，加利福尼亚大学生化科学部开发了利用羟基磷灰石层析进行纯化的方法。利用此法可大规模一步快速纯化小鼠腹水中的单克隆抗体。例如获得腹水后的4 ~ 5小时内，就可回收纯的免疫球蛋白G类。其操作是将腹水以20，000×G离心30分钟再配成约35毫升液体装入60毫升的羟基磷灰石层析柱，用线性梯度磷酸盐（0.01 M至0.3 M）洗脱结合的蛋白，得到三个蛋白高峰。将每个峰的蛋白质收集起来，用酶抗体法（ELISA）和SDS - 多聚丙酰胺凝胶电泳法进行特异抗体活性分析。Ⅲ峰含有大量的免疫球蛋白。新的纯化结果表明，大约90 ~ 95%抗体舞从Ⅲ峰中回收的。一般从每个35毫升层析分离柱可获得200 ~ 300毫克纯免疫蛋白G类单克隆抗体。此法装置可按比例扩大。以接纳更多量的腹水，并可代替耗时长的亲和层析或DEAE - 纤维素层析等方法。

4. 亲和层析法

亲和层析是将配基与活化的载体结合，然后根据配基能与相应大分子进行特异性结合，洗脱不起反应的成分，再解离被配基吸附的大分子。用于单克隆抗体纯化的亲和层析法，以偶联于固相载体的配基不同，分为三种方法，即：蛋白A Sephanse CL-4B法、抗体 – Se-pharose 4B法和抗原 - Sepharose 4B法。

综上所述，自1975年柯勒和米尔斯坦创造以杂交瘤技术生产单克隆抗体的方法以来的十多年中，各国科学家为了改进和完善这类新产品的生产技术，从品种的发展以及杂交、大量培养和纯化等技术的提高出发，不断开拓新的研究领域。虽然涌现出不少新技术或新技术苗子、但是它们距离产业化的要求还相当大。可以说，人单克隆抗体生产的研究才刚刚起步，由于技术上难度高等原因，进展缓慢，至今仍没有建立一株可适用于人 - 人杂交的人骨髓癌细胞系，尚无法进行常规性生产人单克隆抗体，影响单克隆抗体的治疗应用发展。同样，细胞大量培养技术及单克隆抗体的大规模纯化技术仍然处于研究开发之中。这些技术的实用水平可能将在80年代末和90年代初达到。然而，国外杂交瘤技术的研究开发及应用毕竟取得了显著的进展，新的杂交瘤株不断出现，其速度已达到每年大约（鉴定出）一万个。国外现有的杂交瘤细胞株已超过5万个，杂交瘤技术的发展又促进了新的单克隆抗体相继上市，A而使单克隆抗体的应用领域不断扩大。