育种家改良植物品种过去一直是在表型的基础上进行选择。现在，正在构造多数主要农作物的限制性片段长度多态性（RFLP）连锁图谱，这些图谱提供了一种更直接的选择理想基因的方法，其选择是通过理想基因与易于检测的RFLP标记之间的连锁进行的。RFLP与植物育种的结合将可以：（1）促进理想基因在品种间的流动，（2）由亲缘野生种转移新基因，（3）使对复杂的多基因性状能像对单一孟德尔因子组合起来时那样分析，（4）建立不可交配作物间的遗传联系。将奉，高密度RFLP图谱也会使克隆未知产物的基因成为可能，如抗病性或抗逆性基因。

数千年来，人们培育植物都是通过选择那些高产、味佳或具其它诱人之处的个体来进行的，最初由早期的人们选择后来又经现代育种家改良的作物品种构成了今天复杂且高度发达的农业经济。

与生物学的其它方面一样，重组DNA技术对植物科学产生了重要影响。已经克隆了很多植物基因，但这些基因很少与重要农艺性状（如产量或产品品质）有直接联系。这并不奇怪，因为这些重要性状通常是受到复杂的遗传控制的，包含着多个基因的联合作用。

由于缺乏对控制主要经济性状的基因的深入了解，植物育种家便通过选择具有理想表型的植株来培育新品种。但是，植株的表现型不仅由其遗传组成所决定，同时也受到它所生长环境的影响。在很多情况下，环境效应掩盖了基因型效应，因而表现型并不能完全反映植株的遗传潜力，为了解决这一问题，发展了建立在统计学推论基础上的植物育种技术，这些技术在作物新品种的培育中十分有用，但要花费很多时间和精力。对很多作物来说，培育一个优良品种所需的时间通常超过10年。

遗传图谱与植物育种

植物遗传学的发展可追溯到孟德尔对豌豆的经典研究。自那时起，研究者们便在高等植物种中鉴定、记录并绘制单基因标记。农作物的遗传图是属于首批建立的，并先于证明DNA是遗传物质之前。然而，直到最近，用于发展植物图谱的遗传标记仍是那些影响形态学性状的遗传标记，如矮化、白化和叶畸形基因。

科学家早就在理论上提出利用遗传图谱和标记来加速动植物育种过程。在1923年，萨克斯（Sax）提出通过与易于识别的“主效基因”的连锁关系来鉴定“微效基因”，这一思想曾被多次提出，一些研究者对这一概念进行了扩展。

近年来，同功酶作为近中性遗传标记已在植物遗传育种的某些应用方面得到了成功，然而，同功酶分析所提供的遗传标记数目在很多育种应用中是不足的。因此，即使用同功酶做遗传标记，植物育种中遗传图谱的潜力也不能得到充分发挥。

基子限制性片段长度多态性的遗传图谱

限制性片段长度多态性（RFLP）图谱对真核生物遗传学研究的潜在影响力最早是在1980年由人类遗传学家进行了阐述。RFLPs现已在人类遗传学研究中起到了重要作用，根据RFLP标记绘制的人类基因组的第一个完整遗传连锁图已于近期发表。

利用RFLP绘图需要将分子生物学技术用于传递遗传学的基本概念。由所感兴趣的物种克隆单拷贝DNA，并用作探针来跟踪分离群体（如Fa或回交后代）中个体基因组同源区域的分离。由于可以试验多个不同单拷贝克隆，因而可以构建间隔很近的含有大量标记的遗传连锁图谱。

发展RFLP连锁图谱的首要要求是：（1）有性生殖；（2）有单拷贝DNA克隆的来源。多数农作物都是有性生殖，并且对多数种类来说，易于得到大量可以在较长时间保持营养生长状态的后代。单拷贝DNA可以在任何生物中寻找，并且发明了多种选择性地克隆植物基因组中这一部分的方法。

作为应用于植物育种程序的标记，RFLPs与形态学标记有几个重要不同之处。（1）形态学标记通常有以显性/隐性方式互作的等位基因。RFLP由于是直接在DNA水平上筛选的，因而通常表现共显性，使得—个位点的基因型可以在来自任何交配体系的植株中确定。（2）RFLP标记在自然植物群体中如等位变异幅度远大于形态学标记的变异幅度，因此，人们可以利用现有群体的天然变异，不需要构建特殊的遗传库。（3）据认为多数RFLP标记是表型中性的，而形态学标记常引起植物表型的重大改变，这在育种中通常是不利的。（4）形态学标记具有上位性互作，这限制了在同一分离群体中可被明确记载的数目。而RFLP标记则不存在上位性效应，实际上可以追踪无数个。

植物遗传学家和育种学家已开始绘制重要农作物种类的RFLP图谱。至少已有七种植物有了这种图谱，其中不仅包括有较长遗传学研究和基因绘图历史的作物，如马铃薯和玉米，而且也包括以前没有遗传图的作物，如莴苣和番茄。在不远的将来，在多数主要作物中都会绘制出RFLP图谱。

通过与RFLP标记的连锁检测主基因

发现这些标记与所感兴趣基因之间的密切连锁是RFLP标记在植物育种中应用的基础。这类连锁可以使人们通过检测RFLP标记而推定是否存在理想基因。育种家常把很多单基因性状由一种遗传背景转移到另一种遗传背景中，抗病性基因即为一经典的例子，将抗病性基因转移到感病品种中需要先与携有抗性基因的种质杂交，然后在后代中选择具有理想基因组合的个体。对后代是否具有抗病基因的筛选过去一直是靠接种病原，然而，同时甚至连续筛选能抗几种不同病原的植株是困难的或不现实的。此外，由于受到检疫上的限制，育种家不能筛选对新病原的抗性。相反，通过与RFLP探针的连锁来检测抗病基因可以使同时筛选多个抗病基因成为现实，而不需要对群体进行接种。

在马铃薯中，已鉴定出与抗烟草花叶病毒、Fusarium枯萎病、细菌斑、根结线虫病基因以及控制植株习性（SP）和果实成熟特性（u）的主基因密切连锁的RFLP标记。在玉米和莴苣中，研究者已分别建立了RFLP标记与玉米黄矮花叶病毒抗性基因和霜霉病抗性基因间的连锁。研究者正在多种其它作物中寻找类似的与RFLP标记与其它主基因的连锁。

将复杂遗传的性状分解为单基因组份

很多重要的性状是几个基因联合作用的结果。这些性状常被称作多基因性状或数量性状。例如产量、成熟期和抗旱性常呈数量遗传。对于多数数量性状，很少了解其数目、在染色体上的位置以及控制其表达的单个或互作的基因效应。

虽然已证明数量遗传学的理论与技术在数量性状的研究中是有用的，但在育种程序中这些性状仍比单基因性状难于操作。如果能将复杂的性状分解为单一的遗传组份，就可能以单基因性状的效率来处理这些性状。高密度RFLP图谱提供了这种机会，它使人们能够鉴定、绘制和度量数量性状基因的效应。

RFLP标记可被简单地用于检测数量性状遗传位点（简写作QTLs）。两种在一个或多个性状上不同的植株进行杂交，由杂种可获得分离后代（通常为F₂、回交或重组自交系）。在整个基因组有一定间隔（10—20CM）的RFLP标记位点上评价多个后代（通常多于100）的有关性状及其基因型，然后研究分离的RFLP标记与所感兴趣性状的关系。如果发现了这类相关，则表明这是由于RFLP标记与影响性状的基因间存在连锁。

用RFLP检测QTL的能力是QTL对性状作用的大小、群体大小、标记与QTL间重组频率的函数。当RFLP标记与一个QTL在染色体上相距较远时，重组会降低它们被传递到相同后代个体的可能性。链果，根据单个RFLP标记进行的分析可能使检测达不到统计学显著标准，即低估了其效应。间隔性图谱基于对两连锁的标记（其间可含有一QTL）的分析，采用这一方法有助于解决上述问题，这样可减少基因型在标记处与基因型在QTL处不同的可能性，使这种可能性至多为两侧标记间重组百分率的平方。

以RFLP为基础的回交宵种：品种培育的决定性途径

当今的作物品种是多年直接和间接选择的结晶。当从有关的品种或种中引入优良特性时改良通常表现在量值的增加上。这个过程要求具备优良性状的供体（供体亲本）和用来改良的品种（轮回亲本）杂交，从这种组合获得的分离后代是来自双亲染色体片段的镶嵌体，不仅带有优良的性状，或许还带有供体亲本的不良性状。

从供体亲本中引入基因后，为了恢复轮回亲本的优良基因型，回交育种的技术作为一种方法得以产生，在回交育种中，供体亲本和轮回亲本杂交得到的杂种与轮回亲本回交，后代选择目标性状。选中的个体再与轮回亲本杂交，这个程序重复进行，经过几轮之后获得的植株遗传上与轮回亲本几乎完全相同，不同之处是引入了目标性状基因。

RFLP技术的引入有希望克服回交育种的主要缺陷。如果被转移的基因用紧密连锁的RFLP标记，分离群体中目的基因的检测就可在性状表达之前的苗期，进行。由于RFLP可用来标记QTL和主基因，所以用于以RFLP为基础的回交选择所操作的性状类型没有限制。例如在番茄中影响果实重量、PH和可溶性固体物含量的微弱改变的基因已用RFLP做过标记。

采用回交方法顺利实现了品种间的迅速转移。如果没有连锁的RFLP，在育种程序中要追踪这种基因的流动是异常困难和费时的。外来种质利用的新机会原始种和野生种含有大量的遗传变异。事实上，由于品种通常仅仅来自一个或几个祖先种衍生系，并且经历了人类数百年的选择，因此对于特定性状的变异范围来说外来种质通常要比栽培品种大得多。

对有些性状来说，野生种质是目标基因的唯一来源。例如番茄中抗根癌线虫和抗烟草花叶病毒的基因皆来自亲缘种秘鲁番茄。对其它多种病害的抗性和对几种环境迫胁的耐性也都在其亲缘种中发现，但还没有转移。大多数作物的外来种质也同样存在这种潜力，例如小麦野生种质已成为抵抗包括秆锈、白粉和叶锈在内的多种不同病原的基因源。小麦野生种还拥有对环境迫胁有耐性的基因（有待转移）。

育种家早就认识到外来种质对品种改良的潜在价值，但通常不愿利用这种有价值的资源。出现这种抵触情绪的原因在于野生种和栽培种的杂交比较困难，而且杂种通常为部分或全部不育。近年来组织培养和细胞培养解决了一些问题。然而即使获得可育杂种，也不能保证目标性状的基因可成功地转移到栽培品种中，从外来种质转移基因到栽培品种的最直接办法是回交育种。用外来种质育种时连锁网的不良效应尤其容易出现。

从长远来看，利用RFLP从外来种质中获得基因也许是这种技术对植物育种的最突出贡献，将新基因引入栽培种的基因库，RFLP分析有可能改良一些以前因缺乏足够的遗传变异而难以驾驭的性状。

在作物种中确定染色体组的同源性

有关一些重要作物种的遗传学获得了较大的发展。由于多数作物种不能与另外一种杂交，在某种程度上每一物种的遗传学已发展成互相独立、不相交叉的领域，有各自专门的研究人员，在某些情况下还有专门的期刊。

尽管看起来独立，但许多作物享有分类上的亲和性。例如甘蓝、芜菁、油菜子都属芸薹属，玉米和高粱为禾本科的同一族，茄科包括马铃曹、番茄、辣椒，所有这些茄科物种都有相同的染色体基数（x=12），但它们之间不能进行杂交，直到最近关于它们染色体组的词源性还知之甚少。如果染色体上的基因和基因位置在亲缘种间高度保守，那么通过替代一条染色体或者染色体片段（通过体细胞杂交）来组合作物的性状或附加基因还是可能的，而这在物种间的正常杂交中是做不到的。

基于图谱的基因克隆

如果基因的产物是已知的话，那么分离和克隆基因的方法已完满地建立起来。但令人遗憾的是许多重要植物基因的产物是未知的。抗病基因是一个老生常谈的例子。许多抗病基因已用经典遗传学鉴定出来，然而它们作用的机制还不清楚，到目前为止，这些基因的产物还没有明确地鉴定出来，在用分子生物学技术对抗病基因进行分离和研究之前，似乎我们不可能完全了解它们的作用模式。如果这种基因能被分离和克隆的话，有可能通过转化的手段将其引入缺乏抗性基因的作物种中。

基于图谱的克隆提供了基因分离的独立方法。基于与克隆了的RFLP标记的物理连锁来克隆基因的手段，通常称之为反向遗传学。一旦紧密连锁的RFLP标记被鉴别出来，从克隆的RFLP到目标基因人们必须用重叠克隆“走过”，用基因文库“跳过”或者用其它方法沿着染色体移动。反向遗传学已用于克隆包括人类遗传病在内的几种基因。然而用反向遗传学的手段还有两大障碍，首先，必须有鉴定已克隆了的DNA片断的方法，而该片断恰好包括目标基因。其次，虽然目标基因和RFLP可能在遗传学上紧密连锁，但其距离仍可相隔较远。

随着大规模转化技术的发展，有可能对许多克隆进行遗传作用筛选。和其它高等真核生物相比，在植物中决定哪段DNA片断含有目标基因更不成问题。

在非常靠近目标基因的区域，通过鉴别许多DNA标记，可使从紧密连锁的RFLP标记到目标基因的移动简化，因而使沿着基因组必须经过的距离达到最小，还可进行定向。在植物中有一快速检测与许多重要农艺性状紧密连锁的标记的方法。其程序是同时利用几个基因组克隆做探针和近等基因系（NILs）进行索氏印迹杂交，这些近等基因系仅在是否含有目标基因和侧翼DNA小片段上有差异。利用这种手段来检测靠近目标基因的成千克隆是可行的，而且通过回交在多种作物中已培育成很多对近等基因系，因而这种技术将会广泛应用。在番茄中这种策略已成功地用于选择与几个抗病基因紧密连锁的克隆。

结 语

植物育种家对作物生产力的大幅度提高做出了贡献。过去50年来粮食产量的增加有50%以上归于品种改良的作用。很少有人怀疑生物技术对未来的作物改良将有重大影响。生物技术的某些方面，例如人工抗病虫基因的工程将扩大植物育种工作的范畴，并且产生一些以前不存在的性状，另一方面，RFLP技术将渗透到现行的植物育种程序中，允许研究人员以前所未有的速度和精度去接近、转移和结合基因。由于它对植物育种方法的直接影响，RFLP探测将成为生物技术中能与现行育种程序结合起来的首批技术之一，因而也会成为能对农业生产产生影响的首项技术。

RFLP图谱也可能促进从野生种中获取重要基因，这将有助于产量的提高和对极端环境抗性或适应性的增强。利用同一套克隆构建RFLP图谱，可以建立起作物亲缘种间的遗传联系。番茄、马铃薯和辣椒同源图谱的建立便是一个先例。

最后，植物遗传学家和分子生物学家将越来越多地利用RFLP图谱来定位和克隆那些难于用其它方法分离的基因，其中也包括那些产物未知的基因（如抗病基因）和独立效应很小的基因，如多基因性状中的微效基因。

[Bio/Technology. 1989年第7卷第3期］