提要 斯坦利 · 科恩在50年代初曾经是丽塔 · 蒙塔尔子尼在研究神经生长因子（NGF）方面的助手，但是他在研究NGP的过程中发现了NGF所解释不了的生长因子：他紧追不放，终于发现了表皮生长因子（EGF）、作为生化学家，在将近30年的时间里他在生化么细胞水平上系统地研究了EGF及其受体，并因之与蒙塔尔奇尼分享了1986年生理学或医学诺贝尔奖。尽管NGF与EGF还没有在应用方面显露其重要作用，但确实开辟了生物学的新领域。
序 言
就实验胚胎学、内分泌学、细胞生物学、生化学和分子生牿学所提供的基础成就问言，关千胚胎发育过程中所发生的复杂的调控过程的认识进展缓慢。“传统的”激素在调控生长和发育方面的重要性，人们很早就有所认识了：我们现在还知道了许多突与这些高度复合过程的其他的细胞内信号。在这一领域中一些近期的进展还提供了若干机制（而对这些机制的发现，多少有点出乎意料之外），根据这些机制就有可能更详尽地了解诸如肿瘤细胞生长行为的重要生物医学问题。
我个人在这一领域中过去30年的研究工作方向有二（这两个方向都是在生化水平上进行的），对两项生物学观察加以理解，而且这两者都是在华盛顿大学内由维克托 · 汉堡格（Viktor Hamburger）博士领导的动物学科中开始的。
第一项观察是丽塔 · 莱维 - 蒙塔尔奇尼博士所从事的，她发现了，某些小鼠肿瘤植入鸡胚后可以释放一种刺激专一性胚胎神经元生长的因子。第二项生物学观察是我在研究雄性小鼠颌下腺中发现的神经生长因子（NGF）时所进行的。我注意到，向新生小鼠注入颌下赝粗提物以后，意外地出现了一种与NGF的活性无关的“副效应”。这些效应包括眼睑提前张开（对照组为12 ~ 14天，而实验组则为6 ~ 7天），牙齿提前长出（对照组为8 ~ 10天，而实验组则为5 ~ 6天）。
1959年我转到范德比尔特大学生化学科以后，这些“副效应”就成为我的研究的注意点。根据我的胚胎学知识，我感觉到，凡是能够改变专一性发育过程的时间的任何物质，都可能具有生物学价值。当时我当然没有预料到，这些提取物借以引起眼睑提前张开的生化机制，可能相当于一组逆转病毒致癌转化中的机制。
第一个十年
在60年代初我们应用眼睑提前张开作为一种试验标准，得以从小鼠颌下腺中分离得到表皮生长因子（EGF）这一种小蛋白（1962年）。对EGF处理过的和对照的新生动物（小鼠、大鼠、家兔）所进行的组织学检查表明，我们所观察到的眼睑提前张开的效应是广泛得多的生物学效应（即对表皮生长和角化的促进）的一种结局（1963年）。
因为这些试验都是整体动物试验，所以我们便面临着一个课题：该因子是否直接作用于表皮细胞，抑或这种生长是间接诱导而生的（可能由于一种更为“传统的”激素的过度分泌所引起）。
组织培养和器官培养技术看来十分适用于解决这个课题。EGF这个名称就是在这些研究的最初的报告中应用的（1965年）。研究结果表明，EGF直接促进了鸡胚皮肤的器官培养物中表皮细胞的增生；所以EGF的这种促有丝分裂的作用并非一定依赖于其它的系统的或激素的影响。
在1970年以前我们积累起来了一系列信息，足以阐发EGF生理学的许多侧面：
1. 我们描述了伴随着EGF对表皮细胞生长刺激效应的代谢改变。
2. 我们确定了颌下腺的管状细胞是小鼠合成EGF的主要部位；EGF的合成（特别是在雌鼠体内）可因睾酮的注入而明显地增强。
3. 我们证实了，在小鼠颌下腺的粗制匀浆中，EGF是作为一种高分子量的非共价复合物（分子量约75000道尔顿）存在的，组成该复合物的是两个t. GF分子和两个联接EGF蛋白（该蛋白具有精氨酰酯酶活性）的分子。
4. 从较实用的水平来说，我们和其他工作者发现了，局部应用EGF可以促进家兔受伤的角膜再上皮化。
在第一个十年结束之际，我已经深信，EGF在许多种动物中起着一种正常的生理学功能，无论是在胚胎发育过程中，还是在稳态的过程中，均是如此。当时摆在我的面前的是这样的课题：在整体动物水平上其功能如何？在分子水平上EGF与细胞的相互作用如何？
第二个十年
由于在70年代早期出现了从小鼠颌下腺快速分离毫克量mEGF（从小鼠体内分离的EGF）的两步法，所以就有可能纯化足量的mEGF供其彻底的鉴定之用（1972年）。氨基酸分析表明是一种由53个残基组成的多肽，（其残基均属于丙氨酰残基、苯丙氨酸残基或赖氨酰残基）。我们还测定了mEGF的一级结构及其3个内部的二硫键所在的位置。
大约在此同时（1973年）EGF生物学的一个侧面得到了揭示：在组织培养物中成纤维细胞对于EGF具有反应性，并且加强了DNA的合成。
mEGF是人体细胞的强大的促细胞分裂剂这一发现表明了，在人体细胞上存在有EGF的受体，所以在人体组织中可能找到类似EGF的多肽。我们采取了两种方法企图从人尿中分离EGF样分子。首先采用的是免疫亲和柱层析的方法（应用了抗鼠EGF抗体），结果从人尿中部分地纯化了其生物活性类似于这种小鼠激素（科恩把EGF看作是一种真正的激素——译者注）的物质（1975年）。其次我们建立了一种适用于EGF类多肽的特异性放射受体竞争性结合试验，在试验中应用了人成纤维细胞的组织培养和I25I标记的小鼠EGF；应用此法的结果，我们从人尿的浓缩蛋白中分离到了微克量的纯EGF（1975年）。这种纯化的人多状的生物学效应和以前记载的小鼠EGF的效应是一致的。两者的氨基酸顺序虽有差别，但是十分相近。
正如在科学中常常发生的事情一样，在格里哥利（M. Gregory）的报告中出现了EGF的意料之外的一个全新的生物学性状：尿抑胃素（一种从人尿中分离获得的抑制胃液分泌的激素）看来知人EGF是同一的，和小鼠EGF也十分相近。现在人们已经同意这样的观点：人EGF（尿抑胃素）和小鼠EGF在所有的效应细胞中都能引起相同的反应。至于人EGF和尿抑胃素的关系，只有比较这两种分子的结构才能了解；即使到了今天也未能从理论上阐明胃酸分泌的抑制和细胞生长的促进之间的联系。
1975年时由于在一种细胞培养物系统（人成纤维细胞）中EGF已经表明具有“生长因子”的作用，于是我们便面临一个难以应付的任务：EGF是怎样刺激细胞的生长的？虽然1974年已经证明NGF具有神经摄取和逆行运输的功能，但是几乎所有的内分泌学家都主张，多肽激素在与原生质膜上它们的受体结合以后，都会被释放到细胞外的环境之中。
我们应用I25I-EGF和人成纤维细胞的最初试验（1975年），确认了原生质膜有EGF受体的存在。后来又完成了两项有意义的补充观察。首先，I25I-EGF结合于完整的成纤维细胞的表面之后立刻引起该生长因子的蛋白水解性降解。其次，在由Kirsten病毒所引起的转化之后NRK细胞失去了结合I25I-EGF的能力。前项观察促使我们检验一下：与细胞结合的EGF有否可能在降解以前发生内向化的转变（internalization，1976年）。后项观察则在嗣后大大地泛化起来，将逆转病毒所转化的一系列细胞也包括在内（1976年），并且在最后导致乔治 · 托达洛（George Todaro）及其同事分离到一种EGF相关性多肽——α转化性生长因子，并提出了一个自分泌（autocrine）假说（1985年）。
为了了解EGF与细胞表面互相作用的过程中和过程后所发生的各种生化反应，我们追踪了结合状态的该种激素的转归。结果我们得出结论认为，I25I-EGF最初结合于特异性的原生质膜受体之后，EGF：受体的复合物发生了内向化转变，最后该激素便在溶酶体内降解。
对EGF内向化转变的形象是通过如下3类方法加以揭示的：制备和观察EGF的荧光衍生物（1978年）、电镜放射自显影跟踪观察I25I-EGF（1978年）和用电镜观察EGF－铁蛋白结合物制剂并对其进行追踪观察（1979年）。
虽然所有这3种形态学的方法确认了原来用 I25I-EGF所做的生化学研究的结论，具有生物活性的EGF－铁蛋白结合物（F-EGF）提供了EGF代谢转归的最直接、最清晰的图像。在4°C时EGF－铁蛋白结合物特异性地结合到细胞的原生质膜之上，而且看来是随机地分布在特异性的受体部位上。一旦将细胞加温到37°C，原生质膜表面上的F-EGF在1分钟之内就完成了重新分布，结果形成了许多小簇。这些与受体结合的F-EGF分子小簇，接着就很快地内向性转变为细胞内颗粒。在30分钟之内大约84%的铁蛋白可以在多颗粒体（这些多颗粒体被认为是与溶酶体相关的）内见到，这些资料还为如下的假说提供了形态学的根据：细胞表面的EGF表面的“下向性调控”包括了完整的激素 - 受体复合物的内向性转变。
在激素研究的这个领域内有一个至关重要的问题，这就是激素及其受体的编胞内处理是否相关于对该激素的生物学反应的产生？我的意见认为，还没有明确的实验依据来回答这一个非常重要的问题。
由于A-431人表皮样癌细胞系已经证明具有极高浓度的EGF受体（2×106 ~ 3×106受体/细胞）（1977，1978年），所以我们使用了来自这一细胞的膜制剂以寻找膜结构和/或膜功，能的EGF依赖性的改变。正如快速纯化微克量的EGF所提供的技术上的关键性转折一样，A-431细胞系被证明是EGF受体的一个丰富来源，从而为EGF作用机制的生化学和分子生物学研究提供了良好的工具。
主要的磷酸化膜成分已被证明是分子量为 ~ 170000和150000的蛋白。将EGF加入到A-431膜制剂之后，就不仅会促进内源性膜蛋白的磷酸化，而且会促进所加入的许多外源性蛋白基质的磷酸化。
那个时候（1978年）我们曾经主张，膜的磷酸化或与膜相关的诸成分的磷酸化可能是调控细胞生民的细胞内信号之产生的始发事件。
到了第二个十年的结束，由于我们对细胞水平和生化水平上EGF的作用机制的理解有了长足的进步，所以那时我们对前景充满信心。
第三个十年*
由于我们用一个无细胞系统发现了EGF对化学反应的直接效应，遂得以对A-431膜的反应进行较详尽的生化学鉴定，还得以将这一鉴定结果延伸至正常人胎盘和人成纤维细胞培养物的膜制剂（1979，1980年）。
EGF在无细胞的A-431膜系统中如何调控蛋白的磷酸化的呢？我们的研究工作为这一机制提供了下列资料：
1. 由EGF所激活的膜相关性激酶的活性是一个快速的过程，即使在0℃条件下亦然如此；
2. 膜的去磷酸化反应也是以极高的速率进行的，但是它并不受EGF存在的影响；
3. EGF不能使膜释放可溶性蛋白激酶，也不能使其释放该激酶的效应物；
4. 如果用抗EGF的IgG来除掉该膜上的EGF，那么膜激酶的EGF诱导的活化作用便会逆转，从而表明，蛋白水解性激活作用是没有参加在内的。
1979年时我们曾经设想，至少有两个独立的单位是参与其事的，当时的根据是受体和激酶的热敏感性有明显的差别。但是后来出现了两项预料之外的观察，这些观察表明受体活性和激酶活性可能同时存在于同一分子之中。首先，A-431膜可被去污剂所溶解，但是保留了富含EGF的磷酸化活性和I25I-EGF结合活性。其次，EGF受体、EGF依赖性激酶活性以及其基质均可为EGF - 亲和性层析所共同纯化成一个150千道尔顿的大蛋白质。
我们于1979年曾经报导，为EGF激活的蛋白激酶所磷酸化的主要是苏氨酸残基，就某些方面讲，它酷似Rous肉瘤病毒（RSV）转化蛋白的激酶活性。但是不久以后（1980年），别人报告称：RSV相关蛋白激酶和肿瘤病毒激酶所磷酸化的实际上是酪氨酸残基，过去之所以被错误地鉴定为苏氨酸残基是因为在所使用的电泳系统中两个磷酸化氨基酸共同转移之故。以后 我们应用了相似的电泳系统，重新研究了EGF激活蛋白激酶反应的本质，并且发现，亲和纯化的EGF激活受体激酶也是使酪氨酸残基磷酸化（1980和1981年），我们发现这两种激酶是不相同的。
接下来我们的计划便是把EGF受体加以纯化（1982年）。当以前的亲和纯化技术被应用剂A-431膜颗粒之时（在Ca2+存在的条件下），分离到的受体激酶是一个170千道尔顿蛋白。原来在剪碎的膜制剂中观察到的150千道尔顿蛋白被证明是170千道尔顿天然蛋白（这是由Ca2+依赖性中性蛋白酶作用下所产生的）的蛋白水解性片段（1982年）。
无论是170千道尔顿制剂还是150千道尔顿制剂，证明其具有受体特性的不仅根据它们能够结合I25I-EGF的能力，而且也根据能和I25I-EGF呈共价注交联。170千道尔顿制剂和150千道尔顿制剂之间的主要的功能差别似乎在于前者的“自磷酸化”的能力比后者大5 ~ 10倍。这一项观察是可以理解的，因为现在了解到，主要的自磷酸化酪氨酸残基位于靠近170千道尔顿受体的羧基端，但是却不存在于150千道尔顿蛋白水解性片段之中。
我们提出了一个问题：存在于受体制剂上的3类物质（结合性物质、激酶和基质）究竟是位于1个分子上，还是位于几个分子上？后来（1982，1983年）通过一系列试验解决了这个问题（该试验的设计是利用亲和示踪法以鉴定EGF激活的激酶）。如果用5'-p-FSO2BzAdo处理A-431膜颗粒的话，那么EGF激活激酶便不可逆转地遭到抑制。如果用5'-p-FSO2B2[14C]Ado标记A-431膜颗粒，然后进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和自显影，则大部分共价吸附的亲和示踪剂便随着170千道尔顿受体及其150千道尔顿蛋白水解性片段而移动。被观察到的示踪剂所在的位置是ATP结合部位。后来，在A-431颗粒或碎膜标记以5'-p-FSO2B2[14C]Ado以后，对该受体进行了亲和纯化。结果表明，该受体是含有可测知的亲和示踪剂的纯化制剂中的唯一成分。由此我们得出结论，该受体和该激酶是同一多肽的两种物质。最后，如果用低温加热的方法或者用和乙基顺丁烯二酰亚胺相接触的方法使EGF敏感性激酶灭活，那么150千道尔顿和170千道尔顿受体便$能为ATP亲和示踪，所标记。一旦EGF结合于该受体的外物质，其原生质内的催化性物质便可激活，但是这一机制迄今未明（1985、1987年）。
我们于1977、1979、1982年发表的3项试验首先提出了这样一个观点：EGF受体是一个糖蛋白。
为了更全面地理解EGF及其受体/激酶在生长调控中的作用，我将当前世界各地实验室的工作中所获得的主要进展介绍如下：
1. 根据cDNA（互补DNA）克隆的核苷酸顺序的推导，阐明了EGF受体的氨基酸顺序；发现了禽红细胞增多症病毒的erb-B转化基因可能从禽EGF受体中衍生而来（1984年）。
（2）阐明了与前原EGF（prepro EGF）互补的cDNA的核苷酸顺序（前原EGF是一个分子量为128000的蛋白前体）（1983年）。这种EGF前体可能是一跨膜蛋白，可能是其配体迄今未明的一种受体。在这方面具有重要意义的是：在肾脏中发现了前原EGF（1985年）；发现了调控发育的两个EGF相关位点（在果蝇等生物中，1985）；在牛痘病毒基因组中发现了一个EGF相关顺序（1985）。这些发现表明的起源十分古老。
（3）有人在1985年发现，无论是胚胎细胞还是肿瘤细胞都能生产一种EGF相关的蛋白（α-TGF），该蛋白似能与EGF受体相互作用，并且酷似EGF的生物学活性。
（4）1985年及1987年分别有人发现，胰岛素和许多其他生长因子的受体是配体激活性酪氨酸激酶。
虽然我们现在提出了如下的工作假说：由EGF所传递的原发性功能信号是相关于其受体的酪氨酸激酶活性，但是其生长性激活的确切途径未明，特别是在受体与细胞核之间的生长性激活的确切途径迄今尚未阐明。其实这种情况不仅在EGF如此，而且对其他各种其受体为酪氨酸激酶的生长因子，以及其产物为酪氨酸激酶的致癌基因均是如此。
今后方向
（1）我们是否要寻找其功能可为酪氨酸磷酸化所改变的专一性细胞蛋白？
（2）酪氨酸激酶的细胞内易位是否具有生理学意义？
（3）自磷酸化的受体或相关的致癌基因蛋白是否可能起到迄今未明的调控作用？
（4）将促进信号或抑制信号送至细胞核的机制是什么？
（5）在发育和稳态中EGF的生长生理学作用为何？
只有回答了这些问题和一系列其他问题，我们才能充分地了解这一重要的调控系统。
[Les Prix Nobel，1986]
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* 从内容看来，此处介绍的是1980 ~ 1987年间的工作，所以实际上不到10年。——译者注