（上海医科大学）

疫苗接种（Vaccination）是预防病毒性疾病、控制其发生及流行的重要的主动免疫手段。早在200年前，英国乡村医生詹纳（Jenner）就创用了牛痘预防天花，为人类使用的第一个活疫苗。近两个世纪以来，随着微生物学及免疫学的发展，许多新的疫苗不断被研制及应用。通常，疫苗（Vaccine）主要包括减毒活疫苗及灭活疫苗。传统意义上的疫苗主要以诱生保护性的体液（抗体）免疫反应，来预防病毒性疾病的发生。然而，在抗病毒感染的免疫反应中，保护性抗体只能中和游离病毒，消除胞外毒粒；胞内感染病毒则主要依赖特异性的细胞免疫反应，尤其是病毒特异性的杀伤性T淋巴细胞（Cyfofoxic T lymphocytfe，CTL）来清除。并且在许多病毒性疾病中，均不同程度地表现为免疫功能低下或耐受，如何增强及调控机体的免疫应答反应以达到治疗病毒性疾病的目的，已日益备受关注。因此，新型病毒疫苗应不仅能诱生保护性抗体，而且亦应能激发特异性的细胞免疫应答，同时，某些疫苗应具有治疗意义。此外，以抗原表位为基础，精心设计及构建的新型疫苗；以及直接以裸露DNA免疫机体的DNA疫苗等，在病毒疫苗的分子设计中也备受重视。

一、抗原表位（Epitope）

抗原分子通过其表面特殊的化学基团与相应淋巴细胞的抗原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答。这些抗原分子表面的特殊化学基团即为抗原表位。因此，抗原表位是激发机体免疫反应的基本单位。通常，抗原表位由5~9个氨基酸残基组成。这些氨基酸残基以一定的结构特点与MHC分子结合，通过一系列的信号传递，诱生特异性免疫应答。能激活辅助性T细胞的抗原表位称为Th表位；而能刺激机体诱生抗体应答的为B细胞抗原表位；通过激活CTL而表现为特异性杀伤作用的抗原表位称为Tc抗原表位。新近，Paola等在破伤风类毒素（TT）分子中发现及确立了一可在不同MHC个体间均能诱生免疫反应的“多能”T细胞抗原表位（Tu）。因此，抗原分子刺激机体产生的不同类型的免疫应答，实际上是由不同的抗原表位诱生。在病毒颗粒中，几乎所有的结构蛋白或非结构蛋白中，均存在有不同的抗原表位。应用现代分子免疫学技术，可从复杂的病毒蛋白结构中定位及确立相应的抗原表位。并应用合成肽技术，将这些抗原表位进行人工合成。

以往，病毒疫苗多为减毒活疫苗或灭活疫苗。这些疫苗包含有完整或部分的天然病毒蛋白。由于空间障碍（Sterohindrance），许多抗原表位被包裹、隐藏于这些蛋白结构中，而不能诱生相应的免疫应答，而且在这蛋白分子中，除含有Th，Tc及B细胞抗原表位外，亦存在可激活抑制性T细胞的Ts抗原表位而导致免疫抑制。因此，在病毒疫苗的分子设计中，通过确立及合成不同功能的抗原表位，这便使得人们可根据不同的需要，精心设计及人工构建含不同抗原表位的新的疫苗。这些新的疫苗不仅可刺激机体产生特导性的体液免疫反应（B细胞抗原表位）及细胞免疫反应（Tc抗原表位），而且亦可超越MHC分子的限制性，在不同的MHC个体间均诱生较强的反应（Tu表位），同时，由于这种新构建的疫苗类似于天然病毒结构又不完全同于天然病毒。因此可望在特导性免疫功能低下或耐受的机体中重新唤起新的免疫反应，具有十分重要的免疫调控治疗意义。

目前，自流感病毒核蛋白（NP）、HIV gp120蛋白、LCMV麻疹病毒，乙型肝类病毒S/前S蛋白、核心蛋白、腺病毒等许多病毒中均已确立及定位了Tn、B及Tc抗原表位，这些抗原表位有的为线性表位（Linear epitope），有的为构型依赖性表位（conformation dependent epitope）?

二、表位外显（Epitope display）

抗原分子的易接近性是决定疫苗免疫原性强弱，免疫保护效果好坏的重要因素。天然蛋白抗原（如减毒活疫苗或灭活疫苗）由于其结构上的遮掩及空间障碍，许多有效的抗原表位不能外露，其易接近性较差，近年，随着基因工程技术的发展及分子免疫学的研究，人们已可有目的地表达或合成某些抗原表位。一般来说，这些抗原表位分子量较小，结构较简单，直接用作疫苗，其稳定性较差，免疫原性不强。因此必须交联或结合相应的载体。通常以偶氮化交联破伤风类毒素或结合多聚赖氨酸（Poly-Lysine）。虽然以此可增加其分子量及增强其免疫原性，然而交联或结合于载体上的抗原表位，可因载体分子的折叠及盘曲形成新的空间障碍，表位外显即通过新的疫苗分子设计手段抗原表位以固定的方向、方法，选择性地结合于新一类的载体分子，构建新型疫苗。这类新的载体分子包括有SMAA及MAP等。

SMAA为固相基质抗体抗原复合物（Solid Matrix Antibody Antigen Complex），由英国科学家Randall等首次构建。他们以金黄色葡萄球菌菌体蛋白A（SPA）为固相基质，根据抗体分子IgG Fc段可非特异性地与SPA结合的特点，以抗原表位特异性的IgG为桥分子，将抗原表位定向地结合于SPA的表面（IgG的Fc与SPA结合，Fab与抗原表位特异结合），从而达到表位外显的目的。以该种方式构建的新的抗原分子，不仅可包含有B细胞抗原表位诱生保护性抗体，而且亦可结合Tc抗原表位激发CTL反应。在新型SV5病毒疫苗的分子设计中，以SMAA为载体构建的含SV5 HN、NP、P及M四种不同抗原表位的抗原分子，已成功地在免疫的BALB/C小鼠中诱生出病毒特异性的体液及细胞免疫反应。

MAP（Multiple Antigen Peptide）为美国科学家Tam设计及合成的另一类可使抗原表位外显的载体分子。其基本思路是先以人工合成的方法合成以三聚或七聚赖氨酸构成的4价或8价的核心基质。该核心基质与通常概念上的多聚赖氨酸有显著的不同，它不仅分子量小，而且结构清晰、明朗，各活性基因均有规律地分布于核心基质的外侧，通过化学的方法，可将相同或不同类型、种类的抗原表位交联于MAP上，形成一较大分子的多价或多联疫苗。在这一疫苗分子中，各抗原表位均规律地外置于MAP的表面。用该方法，Tam等已成功地构建了一可诱生抗疟原虫体液及细胞免疫应答的新疟疾疫苗。新近，这一思路已应用于多功能乙肝多肽疫苗的设计。

三、空间限构（Comformation constraint）

某些基因工程表达的抗原表位或人工合成多肽，在液相中其空间构型多变而不稳定，从而影响了该抗原分子与淋巴细胞表面受体分子的结合，导致其免疫苗性下降。因此必须将其稳固在一特定的空间构型上。空间限构就是在这一意义上利用分子免疫学手段将某一抗原表位限定在一定的空间构像上，在疫苗的分子设计中具有十分重要的意义。

为了获得稳定的空间构像的疫苗分子。1992年，意大利籍美国科学家M. Zanetti等利用抗原化抗体技术（Antigenzed Antibody，AgAb）成功地实现了抗原表位的空间限构。其基本原理是根据抗体分子重链中第三互补决定区（Complementary determinant region 3，CDR3）可诱生抗独特型抗体，为抗体分子的抗原性区域的特性，同时借助于CDR3环状结构两侧的β片层的空间限构作用，将编码抗原多肽的cDNA序列克隆于CDR3环中，表达出含该抗原多肽的抗体分子。根据这一概念，Billetta等在疟疾疫苗分子设计中，将疟原虫CS抗原中-3次重复的亲水性四肽分子（NANP）3的编码基因克隆于CDR3中，结果表达出具有稳定空间构型的（NANP）3分子。用50 Mg该AgAb免疫小鼠，结果诱生出较强的中和性抗体，并且该抗体可使机体免受疟原虫的感染。更值得注意的是，通过AgAb限构的（NANP）3不仅在对天然CS抗原有免疫应答的H-2b小鼠中可诱生免疫反应，而且在对天然CS抗原无应答的子鼠亦能反应，表明其亦可超越MHC限制性。

在流感病毒多肽疫苗设计中，已知流感病毒A/PR8核蛋白NP—366~379段多肽为Tc抗原表位。然而直接以NP365~379免疫机体却不能诱生CTL反应。Zanetti等以编码NP365~379肽段的DNA序列插入CDR3环中，表达出的AgAB，可诱生MHC-I类分子限制的CTL反应。比较人工合成的NP365~379及AgAB表达的NP365~379，结果发现后者具有十分稳定的、类似于天然蛋白的空间构型。

四、基因疫苗（Genetic Immunization）

通常意义上的疫苗主要为蛋白质，或病毒合成或人工合成或通过基因工程表达。然而，新近一种全新的免疫技术——基因疫苗却已悄然兴起，并已成为疫苗研究的热点。所谓基因疫苗即将目的基因克隆于真核表达载体中，直接将该重组体注入机体，通过该重组体在机体细胞中表达目的抗原，诱生特异性的免疫应答。亦称DNA免疫或核酸免疫。其发现过程十分偶然：美国威斯康辛大学的Wolff等与San Diego，Vical公司的Feigner等在试图用化学方法迫使活的小鼠肌细胞吸收DNA时发现，未加任何化学处理的对照肌细胞吸收了这种裸露的DNA，并高水平表达了外源蛋白。后来证实通过该方法注入的质粒DNA不仅可使目的基因高水平表达，而且可刺激机体产生免疫应答。

1993年，Ulmer等首先报道将流感病毒NP蛋白的cDNA克隆于带有真核启动子的表达载体中，构建NP表达重组体，而后将该重组体直接肌注于小鼠腿部骨骼肌中，二周后在小鼠血清中测得NP特异性的IgG抗体：并且还发现以该方法免疫的小鼠细胞可特异性地杀伤NP致敏的靶细胞，表明DNA免疫在体内还可诱生CTL应答。更有趣的是以该方法获得的免疫，不仅可抵抗同株流感病毒的感染，对异株流感病毒也具预防作用。Michel等的研究也发现，在对天然乙肝病毒表面抗原（HBsAg）先天无应答性的H-2a及H-2f小鼠中，基因疫苗免疫后和可诱生保护性免疫应答，表明该方法亦可超越MHC的限制性。

DNA免疫不仅可诱生特异性的体液免疫反应，而且还可激发机体的细胞免疫，同时亦可打破MHC的限制性，在不同的MHC个体中诱生应答，是一非常有前途、有应用潜能的免疫手段。目前，该技术已被用于流感病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病毒、免疫缺陷病毒等疫苗的实验研究。

定之，随着分子生物学及分子免疫学的飞速发展，许多新的技术，新的概念将有助于病毒疫苗的分子设计及研制，将不断促进病毒性疾病的预防及治疗。