基因疗法原理简单，即将矫正遗传物质插入细胞以缓解病症，但实际上却障碍重重。然而，由于较好传递系统的问世，基因疗法可望获得成功。

用基因疗法治疗疾病的首例临床试验始于1990年。基因疗法技术的概念是，确定合适的DNA序列和细胞类型，建立能将足量DNA插入到这些细胞中的合适方法。应用有效的传递，预期基因疗法的治疗范围包括处理遗传性疾病、延缓肿瘤进程、抵御病毒性感染和阻止神经变性疾病病情发展。然而，缺乏有效传递系统、不能持续表达和宿主免疫反应等问题仍是基因疗法目前所面临的严重挑战。

全球正在进行200多项由几百例患者参加的临床试验，但尚无一例获得成功。这是由于还存在许多技术、后勤和理论问题，这些问题在基因疗法成为常规医疗手段前需要加以克服。

目前仅考虑将基因疗法用于体细胞（非生殖细胞）。虽然许多体组织可接受治疗性DNA，但通常根据疾病性质来选择细胞，有时需要明确靶细胞。例如，已确定囊性纤维变性的缺陷基因，以气溶胶形式将DNA传递到肺部中的临床试验已经开始。虽然有囊性纤维变性表现在肺部，但能否通过该法将矫正基因传递给正确的细胞类型尚不清楚。另一方面，为了矫正凝血功能障碍如血友病，需要在血浆中保持治疗水平的凝血蛋白。该蛋白可通过肌细胞、肝细胞、成纤维细胞甚或血细胞提供。选择能表达治疗性蛋白的组织，最终将取决于基因传递的有效性、蛋白修饰、免疫状况、可及性和经济等因素。

同时也需考虑传递治疗性蛋白的数量。对凝血因子Ⅸ缺乏所致血友病乙，只要有5%的正常循环水平的因子Ⅸ，就能显著改善病情。大多数人血浆因子Ⅸ水平为5 μg/ml血浆，因子Ⅸ由10¹³肝细胞产生。所以只需将矫正基因传递给5%的肝细胞即5×10¹¹细胞。另外，如果每个细胞能产生较多因子Ⅸ，则需要修饰的肝细胞就可减少。然而，在脑部，只需将基因转移给几百个细胞就能显著改善神经疾病患者的病情。最后，可考虑将基因转移给一小部分干细胞（或祖细胞），这些细胞可通过生长分裂产生数百万子代细胞。

基因疗法的关键是基因传递。迄今的问题是不能有效传递基因和持续表达。有两类传递载体。第一类载体为非病毒载体，其中包括直接注入DNA和将DNA与聚赖氨酸或能使基因通过细胞膜的阳离子脂质混合。这些方法大都不能有效传递基因，且基因表达短暂。

现有的基因疗法大都采用第二类载体即病毒载体，保证所用病毒没有任何致病作用至关重要。使用病毒载体是一项有效技术，因为许多病毒具有能将DNA传递给细胞的特异性机理。然而，人体中存在抵御这些病毒的免疫系统，使得通过病毒载体传递基因的企图受到了宿主应答的挑战。

逆转录病毒载体

逆转录病毒是一组RNA病毒，RNA基因组可在感染细胞中转换成DNA。该基因组含有gag、pol和env3个基因，基因序列两侧为长末端重复序列（LTR）。将这些基因整合到宿主基因组中时需要这些LTR，LTR决定了病毒基因组的开端和末端。LTR也可用作增强子-启动子序列，控制病毒基因的表达。被称为包装序列（ψ）的基因组末端成分能用于区别细胞中的病毒RNA与其他RNA。

病毒基因通过病毒基因组操作能被转基因置换。转基因的转录可在病毒LTR的控制下进行，或可用转基因构建增强子-启动子成分，于是将嵌合基因组导入包装细胞中，后者能产生所有的病毒蛋白（如gag、pol和env基因产物），但是这些蛋白已与LTR和包装序列分离，所以仅装配嵌合病毒基因组以产生逆转录病毒载体。将用于包装细胞生长的细胞培养基用于靶细胞，可导致转基因的转移。1ml病毒液可感染培养皿上的100万个靶细胞。

逆转录病毒载体主要缺陷是不能感染非分裂细胞，如组成肌肉、脑、肺和肝组织的细胞。所以可能时，将靶组织中的细胞移出在体外生长，用重组逆转录病毒载体感染后，将能产生外源蛋白的靶细胞转回到动物中。该过程被称为离体基因疗法。作者采用这一疗法用能产生因子K蛋白的逆转录病毒载体感染小鼠原代成纤维细胞或成肌细胞（分别为结缔组织和肌肉前体细胞）。但是将感染细胞移回到小鼠体内5~7天中，因子Ⅸ表达中止，甚至在缺乏功能性免疫系统的裸鼠体内转录也告中止。这不是由于细胞丧失或基因缺失所致，因可找到移植细胞。

这一出乎意料但却饶有兴趣的问题机理尚不清楚。为了在移植感染的成肌细胞后使基因在这些小鼠肌肉中持续表达，作者用肌酸激酶增强子-启动子来控制转基因转录。遗憾的是，这是一个弱启动子，仅产生低水平蛋白。为此，作者构建了一个嵌合载体，肌酸激酶增强子在其中与一个来自于巨细胞病毒的有效启动子连接。应用这一载体，当感染的成肌细胞移植到小鼠体内时，可在两年多的动物生命期内持续地高水平表达因子Ⅸ。所以通过应用合适的增强子，启动子结合，能够克服“表达中止”问题，获得高水平的表达。

离体方法的另一重要问题是移植感染细胞的效力。企图在血友病狗中重复长期的成肌细胞移植仅导致短期表达，因为感染的狗成肌细胞不能与肌纤维融合。所以，当同样的治疗方案推广到人体应用，成功的动物模型可能不合适。此外，由于这些模型建立在近系动物上，所以，远系人群加上个体差异将使问题更加复杂化。造血系统可能便于离体基因疗法，因为在体外可用生长因子刺激静止干细胞分裂。移植技术现已非常成熟，但仍缺乏能使蛋白在这些细胞中高水平持续生产的有效增强子-启动子联合。

另一问题是将载体DNA随机整合到宿主染色体中的可能性。这可导致癌症基因的激活或肿瘤抑制基因的灭活。虽然理论上发生这一事件的可能性很小，但仍令人担忧。

慢病毒载体

慢病毒也属于逆转录病毒科，能感染分裂和非分裂细胞。最著名的慢病毒是人类免疫缺陷症病毒（HIV）。该病毒已被研制成一种失活的用于体内基因传递的载体。与简单的逆转录病毒一样，HIV具有gag、pol和env基因，此外还携带6种辅助蛋白基因，分别是tat、rev、vpr、vpu、nef和vif。

用逆转录病毒载体作为模型，已构建了慢病毒载体，转基因位于LTR和包装序列之间。可去除一些辅助蛋白而不影响载体产生或感染效力。env基因产物限制HIV载体，使它仅能感染CD4蛋白表达细胞，所以可用来自于其他具有更广谱感染性的RNA病毒env序列置换HIV载体中的env基因，如来自于水泡性口炎病毒的糖蛋白。现已能产生这些载体，但产量不大，其浓度是＞10⁹病毒颗粒/ml。

注入到啮齿动物脑、肝、肌肉、眼或胰岛细胞中的慢病毒载体能持续表达6个多月一迄今最长的时间。与原型逆转录病毒载体不同，这种表达不易中止。对慢病毒载体可能引起的免疫问题所知甚少，但是注入10⁷感染单位在注射部位没有引起细胞免疫应答，此外，也没有有效的抗体应答。所以目前慢病毒载体似能为体内基因传递和持续表达提供极好机会。

腺病毒载体

腺病毒属于DNA病毒科，能感染分裂细胞和非分裂细胞，引起人体轻度呼吸道感染。其基因组含有10余个基因，通常不能整合到宿主DNA中，相反可在宿主细胞核中以游离基因（染色体外）的方式复制。通过用目的基因（如因子IX基因）和增强子-启动子元件取代病毒复制所必需的E1基因而能产生复制缺陷型腺病毒载体。重组载体于是能在表达E1基因产物的细胞中复制，它们产生的浓度很高（＞10¹¹~10¹²腺病毒颗粒/ml）。

感染重组腺病毒的细胞应能表达治疗性基因，但由于病毒复制必需基因缺失而使得这种载体不能复制。这些载体可以感染体内细胞，导致它们表达很高水平的转基因。可惜，这种表达持续时间较短（感染后5~10天）。与逆转录病毒载体相反，如果重组腺病毒载体导入裸鼠或同时接受腺病毒载体和免疫抑制剂的小鼠中，可获得长期表达。

免疫应答较强烈，可诱导细胞应答和体液应答。在细胞应答中，细胞毒性T淋巴细胞可杀死病毒感染细胞。体液应答导致抗腺病毒蛋白的抗体产生，如果给动物再次注射重组腺病毒，这些抗体能预防嗣后感染。对基因疗法不利的是，绝大多数人群可能已经自然病毒感染产生了抗腺病毒抗体。

靶细胞有可能含有能刺激腺病毒蛋白合成的因子，从而导致免疫应答。为了解决这一问题，研制了第二代腺病毒载体，其中参与病毒复制的其他基因已被去除。这些载体表现为表达时间较长，但在20-40天后表达明显下降。这一概念正用于构建“无肠”载体（去除所有病毒基因，仅剩下基因组的开端和末端以及病毒包装序列）。这些病毒携带的转基因可表达84天。

在腺病毒载体用于传递基因和产生持续表达以前，需要克服许多免疫学问题。包装DNA的腺病毒蛋白可转移到细胞浆中处理并提呈在细胞表面，将该细胞标记为感染细胞，从而可被细胞毒性T细胞破坏。所以，如果需要短时间的转基因表达，腺病毒载体是格外有用的。一种有希望的方法是将大量含有激活细胞杀伤作用的酶基因或免疫调节基因的腺病毒载体传递给癌细胞。在这种情况下，对病毒蛋白的细胞免疫应答将增强杀灭肿瘤能力。最后，尽管免疫抑制药物能够延长表达期，但是操作的目标应该是载体而不是患者。

腺病毒伴随病毒载体

腺病毒伴随病毒（AAV）是一种新的简单的非致病性单链DNA病毒。它的两个基因（cap和rep）夹在确定病毒开端和末端的末端反向重复序列之间，并含有包装序列。cap基因编码病毒核壳蛋白，rep基因产物参与病毒复制和整合。AAV需要其他基因才能复制，这些基因由一种辅助病毒（通常是腺病毒或单纯疱疹病毒）提供。

该病毒能够感染许多细胞类型，在rep基因产物存在的情况下，病毒DNA首先能整合到人体第19号染色体中。转基因置换rep和cap基因以产生AAV载体。可产生10¹¹~10¹²病毒颗粒/ml，但是在每100~1000个颗粒中仅有一个颗粒具有传染性。此外，载体的制备很困难，由于rep基因产物和一些腺病毒辅助蛋白的毒性，作者目前尚没有能稳定提供所有蛋白的包装细胞。必须从污染的腺病毒中仔细分离载体，AAV载体仅能容纳3.5—4.0千碱基的外源DNA，这将排除较大基因。最后，还需要更多了解病毒蛋白的免疫原性，尤其是鉴于80%的成人循环中具有AAV抗体。尽管有这些考虑，已用含有人因子Ⅸ互补DNA的AAV载体感染有免疫能力小鼠的肝细胞和肌细胞。这些小鼠血液中可产生为期6个月的治疗量因子Ⅸ蛋白，由此表明AAV可望用于体内基因疗法载体。

其他载体

正在开发的其他载体包括可感染神经系统细胞的单纯疱疹病毒。该病毒含有80多个基因，其中IE3基因可被置换以产生载体。可产生10⁸~10⁹病毒颗粒/ml，但残余蛋白对靶细胞具有毒性。可去除其他基因使病毒能包含1个以上的转基因。但是，如果去除所有病毒蛋白（无肠载体），则仅产生10⁶病毒颗粒/ml。许多人对单纯疱疹病毒成分具有免疫力，因为他们以前已经感染。

痘苗病毒载体也已被开发，主要用于疫苗生产。辛德毕斯病毒和西门利克森林病毒正被开发用于可能的细胞浆载体，这种载体不整合到细胞核中。虽然这些系统大多仅短暂产生外源蛋白，但却为现存的基因转移系统提供了多种选择。

临床试验

在美国已开始200项临床试验，一半以上用于治疗癌症。其中大约30项临床试验涉及单基因疾病纠治，如囊性纤维变性、αl-抗胰蛋白酶缺乏症和重症联合免疫缺陷症（SCID）。大多数试验处于I期临床试验（安全性试验），现有的传递系统没有严重毒性作用。此外，可以借鉴以前临床试验经验。

前 景

需要重新强调基因疗法涉及的基础科学，尤其是载体的三维结构、免疫学和细胞生物学。

所有现存的病毒载体均源于对病毒结构和复制的基础生物学了解。现存载体显然需要进一步改善，现正在开发能靶向特定类型细胞的载体。需要系统研究抗体片段、细胞特异性受体的配体或载体化学修饰的应用。对小鼠白血病病毒（一种常用载体）Env蛋白三维结构的了解有助于设计靶向型载体。对基因转录的深入了解有助于设计能调节启动子活性的调节元件，应继续开发组织特异性增强子-启动子元件。最后，需要将病毒载体的某些特性与非病毒载体的特性结合起来，以产生一种安全有效的基因传递系统。

就免疫学而言，病毒仍然具有许多秘密有待解开。能够逃避免疫监测的病毒系统能被掺入病毒载体中。其中有些病毒系统的特性已被弄清，如腺病毒E3蛋白、单纯疱疹病毒ICP47蛋白和巨细胞病毒US11蛋白。其他病原体系统也可被采用，并可掺入到载体中。在有些情况下，矫正蛋白被视作外源蛋白，能刺激免疫应答。动物模型应能有助于理解这点，并在必要时帮助人们拟定免疫耐受性策略。

细胞生物学是基因疗法的重要基础，这是因为在许多情况下基因疗法的目的是矫正分化细胞，如囊性纤维变性中的上皮细胞和腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症中的淋巴细胞。然而由于这些细胞被不断置换，所以要么实施连续疗法，要么把治疗靶向干细胞。首先，需要进一步开发鉴别和分离这些细胞的技术，了解它们的调控机理，并能在体内感染这些细胞。

从临床试验开始以来基因疗法进程如何？基因疗法仍然大有希望，问题已被发现，这些问题可被克服。至于前景如何，作者的观点是，在不太遥远的将来，基因疗法将会像今天的心脏移植手术一样成为常规疗法。

（Nature，1997年9月18日）