土壤植物病原菌根瘤农杆菌是一种复杂的寄生菌，它采用遗传工程的程序迫使感染植物细胞改变其有机碳、氮的运输途径以供应合成侵染细菌能特异异化的营养物——胭脂碱。这种遗传转化的植物细胞受刺激后增生从而形成典型的称之为冠瘿瘤的肿瘤组织。

从根瘤农杆菌中发现了一种大的染色体外质粒，这种质粒携带有负责肿瘤生长和胭脂碱合成以及它自身控制胭脂碱代谢的基因，此后对这一现象进行详细的遗传学和分子生物学分析就成为可能。自此遗传证据就指向那些在根瘤农杆菌中从Ti质粒向植物基因组进行特异转移的基因。

Ti质粒的转座子诱变表明这个质粒中有2个片断与肿瘤形成特性有关，很可能还与DNA从细菌向植物细胞的转移有关。有一个片断（后来称为Uir区段）包含一些基因，它们的钝化会导致肿瘤诱导能力的丧失。另一个片断称之为T区段，它的插入形成的突变株系虽仍能向植物细胞转移DNA，但是这些植物细胞却缺乏合成胭脂碱的能力或者使植物组织产生异常的形态（芽产生畸胎瘤、根形成愈伤组织）。利用这种插入获得的一个引人注目的结果是，位于Ti质粒的T区段内的一个转座子是以物理方式整合入植物细胞基因组的。这个发现证实Ti质粒的T区段以物理方式转移入植物细胞，从而证明Ti质粒能用以向植物细胞引入外源基因。

当Ti质粒的小DNA片断与转化的植物细胞的DNA杂交时，一个严格定义为转移DNA（T-DNA来自这种质粒的T区段）被共价整合入植物核基因组。RNA-DNA杂交表明在植物细胞中T-DNA被转录成大量严格定义为多聚腺嘌呤（polyA）转录子。通过Ti质粒的T区段的转座子突变发生所作的遗传识别可知这些转录子中有一些与T-DNA的功能有相关。

T-DNA肿痕基因编码的酶

基因组中带有T-DNA片断的植物细胞在组织培养中不需要供应生长素、细胞分裂素这类植物激素即可以持续地生长和分裂。T-DNA的基因1、2和4在肿瘤生长控制中起主要作用。单个T-DNA基因的功能是通过含有一个T-DNA基因或特定组合的T-DNA基因的烟草细胞株克隆来确定的。仅含有T-DNA基因1、2或4的烟草细胞株产生不分化的瘤，它与野生型冠瘿瘤无区别；仅有基因1和2表达的细胞产生根、芽组织；那些只有基因4表达的细胞生长成芽畸胎瘤。这些结果证明基因1和2的组合在转化的植物细胞中建立了一条新的植物激素合成途径，而基因4编码一种催化细胞分裂素合成的酶。

这些观察结果大体上可以解释在植物细胞中肿瘤生长的分子机制，同时也为长久以来所持有的关于在植物组织中生长素与细胞分裂素浓度的比例是控制生长和分化的重要信号的观点提供了直接的遗传学证据。有证据表明T-DNA生长素基因1（iaaM）编码一种色氨酸2－单元氧化酶；基因2（iaaH）编码一种吲哚 – 3 - 乙酰胺水解酶；基因4（iptZ）编码异戊烯基转移酶；它们均来源于原核生物并与在其它土壤细菌（这些细菌与植物有共生或寄生相互作用）中发现的相似基因有关连。

T-DNA的转移机制

根瘤农杆菌中有3个遗传元件对Ti质粒的T-DNA向植物细胞中的转移是必不可少的：Uir基因（其位置在T-DNA的边界序列）；染色体毒性基因ChVA和ChVB10。ChV位点是细菌附着到植物细胞的媒介，它的表达是组成型的，所以这些基因的表达在农瘤杆菌寻找植物的机制中起着相当重要的作用，靶子植物细胞在参与细菌 - 寄主细胞相互识别的机制中也可能表达功能。

酚类信号分子例如乙酰丁香酮诱导Ti质粒的Vir基因，这反过来又作T-DNA转移的分子元件运转。未受调节的ChV功能导致识别和附着，特异诱导的Vir功能使T-DNA动员和转移。因此，根痼农杆菌 - 植物细胞的相互作用与一个基本的特殊的（单向的？）DNA转移机制相结合就导致由T-DNA基因引起的植物细胞的遗传克隆。

在Ti质粒上，T区段的两侧各有长25 bp呈正向重复的边界序列。右边界序列（不是左边）对有效的T-DNA转移是必需的。遗传资料表明T-DNA转移通常以极性或取向方式进行，即从右向左。Vir基因表达的活化结果使T - 区段边界序列的底链产生特异位点的缺刻，也使游离的线性单链的T - 区段拷贝产生。VirD启动子编码有关的位点特异性内切酶。转移的极性以及T - 区段的单链拷贝使人联想到细菌接合现象。

基于Ti质粒的基因载体的研制

三个基本的观察资料形成了研制通常用作向植物转移基因的载体的合乎逻辑的基础。

1）被插入Ti质粒T - 区段的外源DNA序列转移入植物基因组。

2）位于T - 区段上的基因没有一个是与负责T-DNA转移和整合入植物基因组的机制有关。这样构建一个“解除武装”的Ti质粒载体pGV3850，其中T - 区段上所有与瘤形成有关的植物激素生物合成基因被全部切除而代之以线性质粒pBR322，它为pGV3850的T - 区段提供了与任何携带有目的基因克隆的PBR322载体衍生物进行共整合的同源性。向pGV3850中引入各种显性选择性标记基因以便能容易地识别出转化植物。为了得到把任何大肠杆菌的pBR322衍生物转移入根痼农杆菌的pGV3850，人们研制出一种三亲株细菌接合系统。其它各种“解除武装”的Ti质粒载体目前也已成功地构建并投入使用。

3）T - 区段不应当与Ti质粒的Vir基因作物理性连接。事实上，任何在两侧带有25-bp通常在Ti质粒的T - 区段为边界的序列的DNA片断，无论是由Ti质粒或是由其它质粒携带，甚或是由细菌染色体所携带，假如农瘤杆菌株系具有功能性的Vir和ChV基因的话，这些DNA片断就会从根瘤农杆菌的寄主转移入植物基因组。这个知识为一些小的“二元”或“反式”Ti基因载体的构建铺平了道路。高度完善的二元系统有二个元件：i）助体Ti质粒，其中整个T - 区段包括边界序列通过缺失全部去除；这个助体Ti质粒提供反式作用的Vir基因产物。ii）广寄主范围质粒，它具有克隆位点和用来别和选择出转化植物的标志基因，以适当的极性在其左右两侧各带有25-bp的T - 区段边界序列。这种系统带有植物标记基因和多个克隆位点、合适的细菌标记基因以及一个广寄主范围质粒的复制和动员功能，所有这些均统一在单个小“载体盒”（vector cassette）中，其基本元件是一个条件性的微RK2复制子（它来源于RK2质粒，并被独立地引进适当的大肠杆菌或农瘤杆菌寄主中），通过反式作用功能来保持和调动，这种载体盒能容易地插入各种载体质粒、转座子及噬菌体衍生物中，从而使它们获得植物基因载体的功能，引入该盒中25 bp重复序列之间的基因就成为T-DNA单元的一部分。

二元载体系统进一步重要的扩展基于这样的结果，即包含有不同T-DNA单元（每一个均以25-bp重复序列为界）的农瘤杆菌株系通常相互独立地转移这些T-DNA单元，很显然反式作用的Vir功能能够调动一个甚或是两个存在于同一根瘤农杆菌中的T-DNA单元。

不同的根瘤农杆菌株系具有不同的寄主范围。能被用来研制最适合于转化特定的植物利（栽培品种）的农瘤杆菌株系的一般战略如下。第一，选择能有效地转化正在研究中的特殊植物栽培品种的野生型农瘤杆菌，把广寄主范围的载体盒引入这些株系。然后选择带有选择性标记基因又能正常发育的植物用以产生含有载体盒T-DNA单元（而不是野生型Ti质粒的T区段）的遗传转化植株。在这方面利用发根农杆菌（A. rhirogenes）作为载体株系或许特别重要。应用这些策略，我们发现许多不同的植物种包括主要农作物中的大多数（可能除去某些禾谷类作物），若以农瘤杆菌的Ti质粒为载体将都适合于进行遗传工程研究。利用这些质粒载体获得的转化植物能按孟德尔方式把引入的基因传递给它们的子代。以这种方式引入烟草的外源基因具有高的减数分裂稳定性。

嵌合基因作为显性可选择标记基因

外源DNA序列插入Ti质粒的T - 区段后就被转移到植物基因钽中，在这一点明确之后的一个首次发现是，虽然编码生长素和细胞分裂素或胭脂碱合成酶的野生型T-DNA基因在植物基因组中具有功能，但是其它细菌基因却不被转录（例如Tn5新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因或Tn7氨甲蝶呤 - 抗性脱氢叶酸还原酶基因）。对这种差异的一个简单解释是，由野生型T - 区段所运载的基因获得了植物基因表达所特有的调节基因序列。为了证实这种观点，提供有效的显性选择性标记基因与“解除武装”的质粒并提供方便的报道酶以简化对植物基因调控机制的功能分析，人们构建了嵌合基因，它们的构建是把来自Ti质粒T区段的胭脂碱合成酵基因的5'端（上游）和3'端（下游）序列与编码像氯霉素乙酰基转移酶（CAT）、新霉素磷酸基转移酶Ⅱ（NPTⅡ）和氨甲蝶呤抗性脱氢叶酸还原酶的细菌基因的编码序列相连接。所有这些构建物在植物细胞中均有活性。对大多数植物来说NPTⅡ是一个良好的选择标记，但是它又是一个良好的却很昂贵和肮脏（高放射性）的报道酶。相反，CAT虽然选择性较低，但它却是一个极为方便的报道酶，特别是在烟草上它仅有极少或根本没有本底酶活性。

现在一般用另外的转录信号序列如花椰菜花叶病毒的35S和19S RNA启动子和从樟鱼碱株系Ti质粒的TR-DNA中得到的长度为479 bp的小二元启动子片断来带动这类选择性标记基因的表达。后一个表达系统有如下优点，这个二元启动子的一侧能驱动一个选择性标记基因，而另一侧能驱动一个检验基因，两个转录活性似乎对位置效应不敏感。此外已研制出新的选择性标记基因和新的更强有力的报道酶。最有前途的可选择标记基因除NPTⅡ外，似乎是哈古霉素磷酸基转移酶（HPT）小鼠氨甲蝶呤 - 抗性脱氢叶酸、还原酶、Tn5博莱霉素抗性基因和phosphinotricine acetyltransferase，最近已研制出两种特别具有吸引力的报道酶并进行了试验。一种是大肠菌β - 葡萄糖苷酸酶基因（GUS），用荧光分析法使极小量（毫克级）的GUS表达都可精确地检测出来。另一种是荧光酶。

虽然荧光酶的表达至今仍未产生能在黑暗中发光的植物，但是这个酶的活性在不同植物组织中能以简单的照度计测定法精确分析。

强化子和弱化子序列

下一个合乎逻辑的步骤是分割植物基因以便评价涉及植物基因表达调控的顺式作用序列主体的复杂性。用以在分子水平上分析的首批基因中的一些是参与胭脂碱合成的T-DNA基因。这些研究说明了为什么这些基因虽然来源于细菌却在植物中具有活性。它们展示了真核生物启动子的共同特征，例如在转录起始点的5'端TATA序列约有30 bp，CAAT序列有60-80 bp。以AGGA一致性序列代替CAAT序列的现象在大多数植物基因中均存在。胭脂碱合成酶基因和其它T-DNA基因，此外还有如玉米朊基因类的植物基因中不存在内含子，这个事实表明重复序列虽然存在于许多植物基因中，但它们对植物基因的表达并不是必不可少的。这也解释了为什么缺少内含子的嵌合基因在植物中能有功能这个问题。

一致性AATAAA序列与植物基因中的polyA有相关，既然植物基因的一般结构基本上与其它真核生物基因相同，下一个目标是鉴别出植物特异性的调控序列。要回答的第一个问题，是此类调控顺序是否位于大量被调控的植物基因的最靠近上游附近，它们是否具有转录“强化子”或“弱化子”的一般特性。在寻找问题的答案时，将考虑涉及植物光合作用、逆境反应和器官特异性的基因。

光合基因   在叶绿体中大多数对光合作用有贡献的蛋白质由核基因编码。两个典型的且作过很好研究的例子，一个是编码二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的基因（ssrbcS），另一个是编码叶绿素c/b结合蛋白的光捕获复合体的基因（LHCP c/b）。这些蛋白质在细胞质核糖体上合成后作为前体多肽或信号肽，然后再转移到叶绿体中。

由于似乎有几个信号转导系统参与植物基因表达的调控，所以这些基因作为研究植物基因表达调控的模型系统特别引人注目。这些基因中的一些对环境条件的变化例如光质和光量的波动作出反应。在豌豆的rbcS基因中，植物光敏色素（也是一种蓝光受体）参与以光为媒介的基因表达的调控。其次，这些基因受到发育控制，试验表明核基因在对叶绿体结构和功能变化的应答过程中表达。在这些基因中包含在转录起始位点上游序列之内的头几百个碱基顺序，足可控制光诱导的植物光敏色素和绿色叶绿体依赖型基因的表达，这一点通过使用这些上游序列来启动引入转化烟草植株的嵌合基因报道酶的表达已得到证实。这首次证明了源于豌豆rbcS基因的长973 bp的上游序列能够驱动光和叶绿体依赖型CAT报道基因的表达。此后的工作又证明了一个与豌豆rbcS的转录起始点相关的长度为280 bp（从-330—-50）的序列参与光的诱导性。

光诱导的豌豆rbcS的顺式作用上游调控序列具有转录强化子的特性。这一点通过将从豌豆rbcS ss3-6基因中得到的上游-90—-973区段获得的一个片断与一个截短的同源启动子或异源（樟鱼碱合成酶）启动子融合，用以驱动报道酶CAT编码基因的表达之实验得到证实。调控的上游序列能够把同源的或异源的截短启动子转变为一个光调节单元。把调控序列与截短启动子的TATA框盒无论是以它的原来方向（-973—-90）还是以相反方向（-90—-973）相融合，光强化作用均相同。

当强化子片断从任一方向与由截短的同源启动子驱动的报道基因的3'端融合，也观察到一种较弱但确定的强化作用。对豌豆LHCP a/b基因的上游调控顺序作同样的分析，不仅证实了光调节的强化子顺序存在，而且还证明了这个基因的上游边界序列（-347—-100）有一个长247 bp的片断具有强化子和弱化子的综合效应。带有一个由樟鱼碱合成酶基因的启动子和Tn5 NPTⅡ编码序列组成的嵌合基因的遗传转化的烟草植株，嵌合基因在其叶片和根部的表达力相同；把这种植株无论在光照或保存在暗处，这种基因的表达力也相同。相似的带有pNOS-NPTⅡ基因的烟草转化植株，但将pNOS-NPTⅡ嵌合基因与豌豆的LHCP α/α基因的247 bp调控元件的5'端上游序列末端融合，情况将与上述相反，若以暗处理时嵌合基因在叶片内表达的咏平为基准，在光照条件下该基因的表达水平要比暗处理时的表达水平高5 ~ 8倍；但是这些植株的根中，这种嵌合基因却不表达，247 bp调控元件的功能在叶片中是一种受光和叶绿体控制的强化子，在根部是一种组织特异性弱化子。

为了检验受光控制的强化子是否也负责其它受光和叶绿体调控的核基因的表达，已从马铃薯的基因文库中分离出一种基因（目前还不知道它的功能）称之为ST-LSI。这是一个可被光诱导的单拷贝基因，仅仅在有光合作用活动的组织中表达。由STVLSI基因的上游序列-334—+11所组成的一个DNA片断，能够在马铃薯和烟草的转化植株中驱动CA7嵌合基因的表达。这个调控元件足以把ST-LSI的质量调控性状提供给相应的嵌合基因。把含有这个元件的一个DNA片断以两个方向与截短的花椰菜花叶病毒35S启动子融合从而证明这个元件有类似强化子的特性。其它距上游很远（远在1600这个位置）的顺式作用元件需要以一种数量方式达到其最大诱导水平。

查尔酮合成酶基因  查尔酮合成酶基因（ChS）特别令人感兴趣，因为它是高等植物中类黄酮糖苷途径中的关键酶，它涉及好几条生物合成途径如花色素苷生物合成途径。

在上述途径中，色素形成主要是与紫外光反应，ChS基因被强有力的长波UV-B辐射所诱导。从金鱼草中分离出ChS基因并研究了其特点。在含有嵌合报道基因的遗传转化植株中，顺式作用调控序列位于基因的上游区段。至已鉴定出二种不同的互相独立存在的顺式调控片断：（ⅰ）—个在诱导后能影响最大表达的位于从-357位点起始的上游区段；（ⅱ）一个包含在紧接TATA框盒的上游序列的长度318 bp的UV-B光反应序列。

有了这种及其它系统（见后面章节），就能开始鉴定那些与起始转录的顺式调控序列相互作用的假定的序列特异性核因子。凝胶延滞分析表明，烟草幼苗的核粗提物中含有1个或多个能与位于-564 —-661之间长度为47 bp的直接重复序列相结合的蛋白质。未经UV-B辐射的烟草幼苗其结合蛋白质基本上存在于胞液组分中，而辐射过的幼苗这种结合蛋白质却主要存在于核组分中。因此，可以相信紫外线诱导的结果，使DNA调控特异蛋白质从细胞质转运至细胞核内。DNA酶Ⅰ指纹加寡区核苷合成竞争试验，揭示出47-bp重复序列内的三个序列似乎直接涉及这种结合。还观察到结合到UV-B光应答序列上的情况，代表位于47-bp重复顺序中结合序列的寡区核苷酸片断不与这种结合发生竞争，这表明还涉及到分开的结合因子。

器官特异性和逆境调控基因   马铃薯块茎是一个值得注意的植物器官。种子或块茎中的储藏蛋白质除了用作蛋白质储藏外，通常都能完成其它功能。因此储藏蛋白质编码基因的研究特别令人感兴趣，因为发育的、器官特异性的及环境的因子在其表达的调控中必然都起作用。我们研究过马铃薯蛋白（patatin）基因和蛋白酶抑制因子Ⅱ基因的表达和调控问题，这两种基因都是编码马铃薯块茎中储藏蛋白质的基因。

马铃薯蛋白是一个俗S，它是一组分子量为40 KD的糖蛋白，它是马铃薯块茎中主要的储藏蛋白。该蛋白由一个多基因簇编码。在正常情况下，这些基因主要在块茎中表达，偶尔也在茎和根中表达，但它们决不会在叶片中表达。某些马铃薯蛋白基因中位于5'端上游区段的调控顺序负责该蛋白的组织特异性表达，证实5'端上游转录调控顺序在植物基因的特异性发育调控上起决定性作用，这或许是最令人激动的结果，它们以下述方式进行：被转录的马铃薯蛋白基因克隆及其3'端下游区段与烟草叶片特异性基因ST-LSI的端上游区段融合，这种嵌合的ST-LSI - 马铃薯蛋白基因用合适的Ti质粒载体引入烟草植株，就获得了带有这种嵌合基因的转化植株，它们含有适当分割的mRNA（马铃薯蛋白基因中有6个内含子）和一个42 KD稳定蛋白，它能与马铃薯蛋白的抗血清反应，表达具有组织特异性即在叶片中最高、茎中较低而从根部检测不到，这很像ST-LSI基因本身的表达情况，由于马铃薯蛋白在烟草叶片中的转录是适当分割和加工的，所以没有器官和种特异性因子参与为这个基因表达所需要的后转录事件。曾推测马铃薯蛋白可能具有脂酰水解酶的活性。因为烟草叶片根本不合成马铃薯蛋白，这就直接证明了在遗传转化的烟草植株中马铃薯蛋白的存在导致在这些组织中脂酰水解酶活性的表现。

在块茎特异性CBNA中间，从马铃薯mRNA得到的克隆有些与蛋白酶抑制因子Ⅱ（P12）mRNA有关。蛋白酶抑制因子通常在未受伤害植株的储藏器官（如种子和块茎）中存在，它们在其它组织如叶片中只有当这些组织受到咀嚼式昆虫严重损伤或是受到机械性损害时才可以检测出其存在。损伤似乎释放出一种信号，可能是从植物细胞壁释放出的一种寡巨糖，这种信号反过来负责对蛋白酶抑制因子基因的诱导。这不仅发生在受伤部位，而且也系统地传导到整个受伤植株，蛋白酶抑制因子或许是植物对昆虫进攻所作出的防御性应答中的一部分。对一个马铃薯P12基因的一个拷贝进行克隆，用之以证明P12基因的转录是处于发育（块茎特异性）和环境（伤害诱导性）的控制下。烟草显然没有与番茄或马铃薯P12基因同源的基因，所以弄清马铃薯基因在遗传转化的烟草植株中是否有功能这是一个饶有趣味的问题。

尽管在大多数番茄和马铃薯组织中P12基因的表达是损伤的结果，但是它也在未受损伤的马铃薯块茎中表达。因此，就产生了这样的问题，基因表达一般是否受到马铃薯块茎损伤的影响。虽然在块茎中稳态蛋白质图谱在机械切割后18小时也未受到明显影响，但是当在体外对受伤的和未受伤的马铃薯块茎分离其mRNA，从而获得蛋白质进行比较时，就得到不同的蛋白质图谱。马铃薯蛋白消失，突出地诱导产生了20 KD蛋白。用区分杂交法得到了由损伤的马铃薯块茎特异性诱导的代表mRNA的两个不同的cDNA克隆（wun1和wun2）。在未受损伤的块茎中未检测到这些克隆的表达。然而，wun1和wun2的mRNA分别在损伤后30分钟和4小时即可检测出来，8-14小时后达到最大表达。初步证据表明wun1和wun2编码先前观察到的20 KDS白。截然相反的是，马铃薯蛋白的稳态水平剧烈地下降，在损伤后30分钟就很难检测到。损伤对wun1和wun2 mRNA的诱导，以及对马铃薯蛋白mRNA的抑制，分别证明是由于对转录起始的诱导和抑制。很可能wun1和wud2在单倍体马铃薯基因组中相当于单基因，这些相应的基因被隔离。wun1和wun2也在受损伤的茎中表达，在叶片和根部表达的程度较小些 · 对P12基因来说，损伤诱导信号是一种寡巨多糖，但这似乎不适用于wun1和wun2。马铃薯蛋白的抑制似乎要通过乙烯这一媒介。

热诱导基因   对动、植物热激基因的结构分析揭示在这些基因的5'端区段含有一个保守的热激均一序列或称为热激元件（HSE）。HSES含有担负对基因表达进行热诱导控制的顺式调控顺序。将果蝇HSP70基因的HSES与一个报道酶的编码顺序相连接构建成一个嵌合基因。遗传转化的烟草植株能表达出这个嵌合基因，它可以在愈伤组织、根、茎部以及叶片中表达，但不能在花粉中表达。根据这些或其它参数，果蝇的HSES大体上是以植物内源性热激基因相同的方式调控其表达。很显然有一种烟草的热激蛋白活化因子能够准确识别果蝇HSE顺式调控元件。所以，这种类型的逆境应答机制在进化过程中必然是相当保守的。

真菌引出物诱导的基因   培养中的欧芹细胞用真菌菌丝的细胞壁制备物（引出物）处理会使这些细胞分泌出具有抗真菌活性的香豆素衍生物。这种反应被认为是植物防御病原菌攻击的某些机制中的典型。已经分离出几种涉及抗真菌物质（植物保卫素）的基因，对这个系统的信号转导和基因活性分析，将有利于证明通过诱导涉及植物保卫素合成的基因的转录，使欧芹原生质体恢复了与引出物进行特异反应的能力。这种欧芹原生质体也可被用来以瞬时表达分析法研究DNA直接吸收后嵌合基因表达的调控。

共生细菌诱导的基因  土壤细菌如固氮菌和豆科植物的共生会形成称之为根瘤的非常特化的器官，在根瘤发育过程中大约有30种不同的植物编码蛋白质（瘤蛋白）特异性合成。其中最有名的是豆血红蛋白，已经克隆了编码四种不同豆血红蛋白的不同基因，它们组合成两个簇。把大豆血红蛋白lbc3基因的5'和3'区段与CAT报道酶的编码序列相连接，构建成的嵌合基因引入杂合豆科植物Lotus corniculatus中时，在未受侵染的转化植株中的任何组织均检测不出该基因的表达；可是当这种植株的根部被Rhirobium loti侵染后，在根瘤发育的确定阶段（此时豆血红蛋白通常被诱导）就检测到一个高水平的CAT表达。用凝胶延滞分析法分析大豆lbc3基因5/端区段的不同序列，发现有反式作用调控因子担负这种根瘤的特异性诱导，根瘤的提取物（但不是根的提取物）内含有能与先前所确定的在lbc3基因5'端上游区段内顺式作用的调控元件作特异性结合的蛋白质。用确定的寡聚苷酸竞争结合的实验证明，有两个富含AT的序列主体直接与根瘤特异性蛋白质的结合有关。

经研究过的所有基因都检测出强化子或弱化子类型的顺式调控序列，部分还研究过它们的特征。在所有情况下，有可能构建表达性载体，在它们中这些调控元件被用以驱动植物中外源基因的调控性表达。

用于转移入叶绿体的外源蛋白质靶子

叶绿体蛋白质中有一大部分是由核基因编码，在游离的细胞质核糖体上以大前体蛋白质的形式合成，前体蛋白质有一个氨基末端延伸即转变肽，伴随着向叶绿体中转移的过程，这个转变肽从成熟蛋白质上切割下来。为了决定转变肽和成熟蛋白质在转移机制和转移效率中的相对作用，人们作出了很大的努力。将ss'rbcS基因中仅仅编码转变肽的序列，或编码这个肽以及成熟蛋白质氨基端氨基酸的序列与作为报道酶的N-PTⅡ基因融合，在离体培养下产生的带有这个嵌合基因（或融合蛋白质）的遗传转化植株和与纯化的完整叶绿体相组合用来证明，虽然转变肽本身对融合蛋白质的转移就足够了，但是成熟蛋白质中氨基末端残基的存在对高效率的转移却是不可缺少的。

用基因标记技术分离植物基因

由于巴巴拉 · 麦克林托克的工作，人们对植物的可转座因素已有了清楚的认识，这些转座因素已经被克隆出来，并被用作分离因它们的插入而发生可逆突变的基因的探针。该方法中的费时步骤，是对突变植株的遗传分析。不过，用标记位点进行分子分离却是直截了当的方法。

这个方法在植物中是行之有效的。由于当玉米控制因素Ac用Ti质粒载体转移入烟草中，显示出它从T-DNA的原始位置切割下来并整合入烟草基因组中，此时并没有可转座因素和其克隆产生。通过构建一个NPTⅡ基因，它的表达因Ac因素的插入而被阻止，这样就得到一个在外源寄主植物中Ac转座活性表型检测的方便系统。

以根瘤农杆菌为媒介的转化，其本身会导致T-DNA片断的随机整合，它也可以作为一种基因标记。为此目的对某些Ti质粒载体已进行过特殊地设计。基于T-DNA的标记的潜在优点，是它在大多数遗传转化的植物细胞中在单一位点插入。相对于转座因素来说，其不利之处是缺少可逆的突变体表型，这是证明突变体表型是基因标记插入的直接结果的最便利的方法。

迄今为止用基因标记法分离出的最重要的基因是玉米的C1位点，它是控制花色素苷生物合成的一个调控基因。C1基因编码两个重叠转录子，其中一个作为完整的cDNA已被克隆，它的序列显示出一个与DNA - 结合myb原癌基因的产物同源，并具有类似于酵母GALA - 编码的转录活化子结构的蛋白质顺序。

基因转移作为植物育种的一种附加工具

虽然遗传转化植株实际表达出嵌合基因的首次报道在1983年，但是我们已经目睹了实际应用于植物育种上的这些方法。毫不奇怪，在所有早期的例子中用于转移和表达的是单基因，它们中一些来源于细菌基因。或许最有希望的例子是涉及使植物免受非选择性除草剂为害的基因，其它例子是有关昆虫控制或耐病毒侵染的基因。这些不过是主要应用的最初例子，但它们证明了这种途径的效用和潜力。或许有争议的是，农瘤杆菌的寄主范围有限，某些最重要的农作物像禾谷类作物，并不适于用所描述的基因转移技术。然而，在不久的将来这些技术将适合于把基因引入包括主要禾谷类作物在内的几乎所有的农作物。

这些技术有一些将相当简化，与农瘤杆菌系统本身的精密机制相比较就显得通俗易行。确实如此，用一个注射针头把编码一种可选择性标记基因（NPTⅡ）的DNA直接注射入正处于发育中花序的黑麦分蘖穂中，显然会使正在发育的种层细胞基因组吸收DNA。从几百个注射植株内获得3000粒种子，由此得到3株相互独立的含有并表达出转移入的卡那霉素抗性基因的转化植株。由一个观察结果引出了一种更直接的禾谷类作物的基因转移方法。从干种子中用机械分离法分离出成熟小麦胚能通过在DNA溶液中吸涨的方式吸收DNA，并瞬时表达出嵌合的NPTⅡ基因，这些DNA处理过的胚能容易地培养成完整植株。它们的子代是否能传递被引入的DNA的整合拷贝尚有待证实。

[Science，1987年第237期]